超聲波輔助提取野桂花蜜中多酚的工藝優(yōu)化

王 雨 單 楊 李高陽(yáng)

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省農(nóng)科院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

野桂花蜜中的酚類化合物是一種天然的抗氧化劑［1］。天然抗氧化劑具有無(wú)毒害的特點(diǎn)，可以有效地抑制人體內(nèi)的自由基［2－5］。目前對(duì)蜂蜜多酚的提取多采用傳統(tǒng)的浸提法或是直接粗略萃取后進(jìn)行純化，存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低的問題。

超聲波輔助提取法由于操作簡(jiǎn)便，提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中有效成分的提取［6－8］。超聲波能產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，可以高效地提取天然活性成分［9］。本研究擬以野桂花蜜為原料，采用超聲波輔助提取野桂花蜜中的多酚化合物，再用響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝參數(shù)，從而為獲得更高得率的多酚化合物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野桂花蜜：產(chǎn)自洞庭湖畔，低溫保存，湖南省明園蜂業(yè)有限公司；

Folin－酚試劑：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；

乙酸乙酯、鹽酸、碳酸鈉：分析純，上海試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：AUW220D型，日本島津有限公司；

超聲波清洗器：KQ－500DTV型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外－可見分光光度計(jì)：UV－1700型，日本島津有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EV311型，上海垣欽自動(dòng)化科技有限公司；

循環(huán)水真空泵：SHZ－III型，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 配制濃度為0.1mg/mL的原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于10mL的容量瓶中，加入福林—酚試劑1mL，用玻璃棒攪勻，然后加入1mol/L的碳酸鈉溶液5mL，定容搖勻，常溫下避光靜置1h，于765nm處測(cè)吸光度。以原兒茶酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到的回歸方程為y＝150.71x＋0.004 3（R2＝0.999 8）。

1.3.2 野桂花蜜多酚化合物的超聲波輔助提取 準(zhǔn)確稱量10.0g野桂花蜜于50mL的錐形瓶中，將一定溶劑濃度的乙酸乙酯溶液，按照不同料液比加入錐形瓶中，磁力攪拌1min后，將錐形瓶置于超聲波發(fā)生器中一定溫度下提取一段時(shí)間后，趁熱分離合并上清液。然后真空濃縮至膏狀物，用4mL乙醇溶解，在765nm下測(cè)定吸光度。

1.3.3 多酚化合物得率的測(cè)定 多酚化合物得率按式（1）計(jì)算：

式中：

Y——多酚得率，mg/10g；

C——測(cè)得的多酚濃度，mg/mL；

V——乙醇溶液體積，mL；

M0——原料的質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）溶劑濃度對(duì)多酚得率的影響：固定料液比為1︰10（m︰V），超聲波時(shí)間為20min，超聲波溫度為50℃，考察不同溶劑濃 度（30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%）對(duì)野桂花蜜多酚得率的影響。

（2）料液比對(duì)多酚得率的影響：固定溶劑濃度為60%，超聲波時(shí)間為20min，超聲波溫度為50℃，考察不同料液比（1︰4，1︰6，1︰8，1︰10，1︰12，1︰14，m︰V）對(duì)野桂花蜜多酚得率的影響。

（3）超聲波時(shí)間對(duì)多酚得率的影響：固定溶劑濃度為60%，料液比為1︰10（m︰V），超聲波溫度為50℃，考察不同超聲波時(shí)間（10，15，20，25，30min）內(nèi)野桂花蜜多酚得率的變化規(guī)律。

（4）超聲波溫度對(duì)多酚得率的影響：固定溶劑濃度為60%，料液比為1︰10（m︰V），超聲波時(shí)間為20min，考察不同超聲波溫度（30，40，50，60，70℃）對(duì)野桂花蜜多酚得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以野桂花蜜多酚提取得率為響應(yīng)值，選取溶劑濃度、料液比、超聲波時(shí)間、超聲波溫度4個(gè)影響因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 溶劑濃度對(duì)多酚得率的影響Figure 1 Effect of concentration of solvent on yield of phenolic

2.1.1 溶劑濃度對(duì)野桂花蜜多酚得率的影響 由圖1可知，溶劑濃度在60%以前，野桂花蜜多酚的得率隨著溶劑濃度的增高而增多。當(dāng)溶劑濃度到達(dá)60%之后，野桂花蜜多酚的得率呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢(shì)。溶劑濃度到達(dá)90%時(shí)，野桂花蜜多酚的得率降低至56.80mg/10g。這是因?yàn)殚_始時(shí)隨著溶劑濃度的增高，野桂花蜜中多酚化合物與提取溶液的接觸機(jī)會(huì)越來(lái)越多。當(dāng)濃度到達(dá)60%之后，水分占比減少，野桂花蜜中的大分子糖類由于極性差異不能溶出，使得提取時(shí)有結(jié)晶未溶的現(xiàn)象。這使得其中的多酚沒能充分溶解出來(lái)，提取量反而減少。所以，選擇最佳的溶劑濃度為60%。

2.1.2 料液比對(duì)野桂花蜜多酚得率的影響 由圖2可知，隨著料液比的減少，野桂花蜜多酚的得率逐漸升高，當(dāng)料液比達(dá)到1︰10（m︰V）時(shí)，野桂花蜜多酚的得率不再上升。其原因是隨著溶劑的增加，多酚化合物更易接觸到提取溶劑，多酚得率也就越大。當(dāng)料液比達(dá)到1︰10（m︰V）時(shí)，多酚化合物已基本被提取出來(lái)，繼續(xù)加入溶劑，起不到提高提取率的作用，高用量的溶劑反而不適于提取，同時(shí)，出于節(jié)約成本考慮，料液比選擇1︰10（m︰V）為宜。

2.1.3 超聲波時(shí)間對(duì)野桂花蜜多酚的影響 由圖3可知，在20min內(nèi)，野桂花蜜多酚得率隨超聲波時(shí)間的增加而增加，20min后，野桂花蜜多酚得率隨超聲波時(shí)間的增加反而出現(xiàn)下降。0～20min的過(guò)程中，由于超聲波的空化作用，其提取速度得到提升，野桂花蜜多酚得率提升顯著［10］。在20 min后，多酚化合物基本被提取出來(lái)，同時(shí)，由于過(guò)長(zhǎng)的超聲波作用，使得多酚化合物中一些不穩(wěn)定的成分被破環(huán)［11］，所以出現(xiàn)了下降。故確定提取過(guò)程的最佳超聲波時(shí)間為20 min。

圖2 料液比對(duì)多酚得率的影響Figure 2 Effect of rate of solid to solution on yield of phenolic

圖3 超聲波時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic time on yield of phenolic

2.1.4 超聲波溫度對(duì)野桂花蜜多酚的影響 由圖4可知，在溫度低于50℃時(shí)，隨著溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，使得多酚化合物的得率迅速提升，在50℃繼續(xù)往上升溫時(shí)，發(fā)現(xiàn)野桂花蜜多酚的得率隨溫度的上升有明顯的下降。原因可能是多酚化合物中的熱不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)在高溫作用下被破壞［12］。而且過(guò)高的溫度會(huì)促進(jìn)水分和乙酸乙酯的揮發(fā)，從而影響多酚得率。故選擇最佳提取溫度為50℃。

圖4 超聲波溫度對(duì)多酚得率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic temperature on yield of phenolic

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［13］，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案見表1，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of respnse suirface analysis

表2 Box－Behnken設(shè)計(jì)方案及野桂花蜜多酚得率的測(cè)定結(jié)果Table 2 Box－Behnken matrix and respenses values of phenolic compounds yield

通過(guò)Design Expert V8.0.6軟件對(duì)表2中的野桂花蜜多酚得率進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到回歸方程：

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析（見表3），此回歸模型顯著（P＜0.000 1），而且上述回歸方程的決定系數(shù)R2＝0.969 5，＝0.939 1，說(shuō)明96.95%的數(shù)據(jù)可以用此方程模型解釋，模型可以真實(shí)地反應(yīng)各個(gè)因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。與此同時(shí)，失擬項(xiàng)P值為0.072 6＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著說(shuō)明此回歸方程擬合度很好，試驗(yàn)誤差小。因此可以用該回歸方程分析和預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。由表3可知，一次項(xiàng)X1、X3和X4均達(dá)到極顯著水平，X2不顯著，而二次項(xiàng)的影響均為顯著，說(shuō)明各因素對(duì)野桂花蜜多酚的影響并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表3 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis for the experiment result

表3 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis for the experiment result

＊＊.P＜0.01，差異極顯著；＊.P＜0.05，差異顯著；R2＝0.969 5；＝0.939 1。

來(lái)源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 顯著性X1 278.40 1 278.40 53.10 ＜0.000 1＊＊X2 21.87 1 21.87 4.17 0.060 4 X3 62.42 1 62.42 11.90 0.003 9 ＊＊X4 384.54 1 384.54 73.35 ＜0.000 1 ＊＊X1X2 34.86 1 34.86 6.65 0.021 8 ＊X1X3 60.21 1 60.21 11.48 0.004 4 ＊＊X1X4 2.32 1 2.32 0.44 0.516 2 X2X3 47.19 1 47.19 9.01 0.009 5 ＊＊X2X4 19.49 1 19.49 3.71 0.074 3 X3X4 8.73 1 8.73 1.66 0.217 7 X12 1 017.19 1 1 017.19 194.04 ＜0.000 1 ＊＊X22 267.98 1 267.98 51.12 ＜0.000 1 ＊＊X32 372.09 1 372.09 70.98 ＜0.000 1 ＊＊X42 434.17 1 434.17 82.82 ＜0.000 1 ＊＊模型 2 336.58 14 166.90 31.84 ＜0.000 1 ＊＊失擬值 67.72 10 6.77 4.78 0.072 6純誤差 5.67 4 1.42總和2 409.97 28

2.2.2 響應(yīng)面分析 通過(guò)回歸方程，固定其中一個(gè)因素在0水平，可以得到另兩個(gè)因素之間的交互作用的響應(yīng)面圖（見圖5）。從圖5中可直觀地看出響應(yīng)面的優(yōu)化區(qū)域和各個(gè)因素對(duì)野桂花蜜多酚得率的影響程度。結(jié)合回歸方程以及表3的數(shù)據(jù)可知：超聲波溫度對(duì)多酚得率的影響最為顯著，響應(yīng)值變化最大，同時(shí)曲線較陡。而料液比對(duì)多酚得率的影響最小，響應(yīng)值變化較小，同時(shí)曲面比較平滑。綜合后可以得出對(duì)野桂花蜜多酚得率的影響程度從大到小的順序依次為超聲波溫度＞溶劑濃度＞超聲波時(shí)間＞料液比。

2.2.3 最佳工藝條件的驗(yàn)證 通過(guò) Design Expert V8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)值（多酚的得率）進(jìn)行優(yōu)化分析，得到最佳提取條件為 X1（62.45）、X2（1∶9.94）、X3（21.22）、X4（53.75），即溶劑濃度62.45%，料液比1︰9.94（m︰V），超聲波時(shí)間21.22min，超聲波溫度53.75℃，野桂花蜜多酚得率的理論值為68.952mg/10g。為方便實(shí)際操作，取溶劑濃度62%，料液比1︰10（m︰V），超聲波時(shí)間21min，超聲波溫度54℃，對(duì)提取野桂花蜜多酚工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n＝3），得到野桂花蜜多酚的平均得率為68.27mg/10g，達(dá)到了理論值的99%，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝得到的條件參數(shù)可靠。2.2.4 超聲波輔助提取法與傳統(tǒng)浸提法的比較 由表4可知，傳統(tǒng)浸提法得到的野桂花蜜多酚的平均得率僅為52.48mg/10g。而超聲波輔助提取法提取野桂花蜜多酚的得率比傳統(tǒng)浸提法得率高出23%，而且大大節(jié)省了提取時(shí)間。

圖5 各因素交互作用對(duì)野桂花蜜多酚得率影響的響應(yīng)面圖Figure 5 Response surface plots for extraction yield of phenolic compounds from wild osmanthus－scented honey in function of the factors

表4 提取方法對(duì)野桂花蜜得率的影響Table 4 The effects different extraction methods on the yield of wild osmanthus－scented honey（n＝3）

3 結(jié)論

通過(guò)Design Expert V8.0.6軟件，以溶劑濃度、料液比、超聲波時(shí)間、超聲波溫度為自變量，野桂花蜜多酚的得率為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到的回歸模型擬合度好，誤差小，能夠用回歸模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，有一定的應(yīng)用價(jià)值。優(yōu)化驗(yàn)證后得到的野桂花蜜多酚提取工藝條件為：溶劑濃度62%，料液比1︰10（m︰V），超聲波時(shí)間21min，超聲波溫度54℃。野桂花蜜多酚的得率為68.27mg/10g。超聲波輔助提取法比傳統(tǒng)浸提法的多酚得率高出23%。野桂花蜜中的多酚化合物的得率，可能會(huì)受蜜源地環(huán)境影響，如氣候和蜜源植物本身狀況等，因此有待進(jìn)行深入研究。

1 聶乾忠，夏延斌，曾曉楠.三種天然抗氧化劑對(duì)冷鮮兔肉保鮮效果研究［J］.食品與機(jī)械，2012，28（5）：155～158.

2 凌關(guān)庭.抗氧化食品與健康［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：5～12.

3 李愛軍，歐仕益，劉紅.一種天然抗氧化劑復(fù)合物抗氧化作用的研究［J］.食品與機(jī)械，2001（4）：28～30.

4 Hao Rui－xia，Zhou Shuai，Yang Yan，et al.Flavone content and bioactivity of aqueous－ethanolic extracts of phellinus fruit bodies［J］.Acta Edulis Fungi，2008，15（2）：27～30.

5 Aqula S，Giner R M，Recio M C，et al.Anti－inflammatory activity of flavonoids from cayaponia tayuya roots［J］.Journal of Ethnopharmacology，2008，121（1）：333～337.

6 賴紅芳，黃秀香，陸俊宇，等.超聲波輔助提取山豆根中的黃酮和多糖工藝優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2014，30（1）：196～198，223.

7 杜寅，李奇，丁輝煌.多頻超聲波輔助提取石榴皮中原花青素的研究［J］.糧食與食品工業(yè)，2007，14（4）：22～24，29.

8 曹增梅，黃和.超聲波輔助提取番石榴中多酚類物質(zhì)的研究［J］.食品與機(jī)械，2012，28（5）：123～126.

9 鄔方寧.超聲提取技術(shù)在現(xiàn)代中藥中的應(yīng)用［J］.中草藥，2007，38（2）：315.

10 王靜，韓濤，李麗萍.超聲波的生物效應(yīng)以及在食品中的應(yīng)用［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，21（1）：67～72.

11 Krystyna Pyrzynska，Magalalena Biesaga.Analysis of phenolic acids and flavonoids in honey［J］.Trends in Analytical Chemistry，2009，28（7）：900～901.

12 金瑩，孫愛東.植物多酚的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性的研究［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2005（9）：27～29.

13 Box G E P，Hunter W G.Statistics for experiments：an introduction to design，data analysis and model building［M］.New York：John Wiley ＆Sons，1978.