金桂花中總黃酮的微波輔助提取工藝優(yōu)化

陳鐵壁 肖 樂 楊盟盟 彭云鳳（湖南科技學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 永州 425100）

黃酮類化合物是植物在長(zhǎng)期自然選擇過程中產(chǎn)生的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物、以黃酮（2－苯基色原酮）為母核而衍生的一類黃色色素，作為天然抗氧化劑的一種，其具有清除體內(nèi)自由基，延緩衰老，增強(qiáng)機(jī)體免疫等生理活性［1，2］，如蘆丁、槲皮素等，因其生理活性眾多，深受國(guó)內(nèi)外研究人員關(guān)注，目前已發(fā)現(xiàn)8 000多種［3］。

近年來，微波萃取因提取時(shí)間短、萃取效率高、溶劑消耗低、產(chǎn)生污染小、所需設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而倍受各領(lǐng)域研究人員的廣泛重視［4，5］。桂花中蘊(yùn)含著豐富的黃酮類物質(zhì)，朱沛沛等［6］采用功率300W、微波連續(xù)提取120s，桂花總黃酮提取率達(dá)16.61%。本研究擬在此基礎(chǔ)上，以金桂花為原料，通過間歇式微波輔助提取，探討乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比和微波功率四因素對(duì)金桂花中總黃酮提取率的影響，從而確定出最佳的提取方法及總黃酮含量，為微波輔助提取桂花總黃酮工藝的完善提供科學(xué)依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金桂花：摘選自湖南科技學(xué)院校園；

蘆丁：分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)；

石油醚：分析純，淄博市臨淄東方紅化工廠；

無水乙醇：分析純，深圳市華昌化工有限公司；

硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)專用微波爐：NTJ07－3型，南京金微波設(shè)備有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：UV－2600型，上海舜宇恒平有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－3型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

電子天平：BS－124S型，德國(guó)賽多利斯公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52A型，上海亞榮生化儀器廠；

中草藥粉碎機(jī)：WF－117型，天津天斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和最大吸收波長(zhǎng)的確定 準(zhǔn)確稱取20mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，以30%的乙醇溶液溶解，并于100mL的容量瓶中定容，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2mg/mL）。為確定其最大吸收波長(zhǎng)，以溶劑為空白，于200～760nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行可見－紫外掃描。準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1，2，3，4，5 mL，分別置于25mL的容量瓶中，先后加入30%的乙醇溶液10mL，5%的NaNO2溶液0.7mL，搖勻后，加入10%的Al（NO3）3溶液0.7mL，4%的 NaOH 溶液5mL，混勻后，用30%的乙醇溶液定容至25mL，靜置10min，于上述最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值度（以溶劑為空白對(duì)照）。分別以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，體系吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3.2 金桂花中總黃酮的提取

（1）原料預(yù)處理：將新采摘的金桂花洗凈，干燥，粉碎，過60目篩，于低溫避光條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）金桂花中總黃酮的微波輔助提取：稱取金桂花粉末若干，放入三角瓶中，加入適量溶劑，混勻，于微波爐中在設(shè)定功率下間歇萃取一定時(shí)間后，取出待測(cè)溶液，冷卻至室溫，減壓抽濾，即得金桂花中總黃酮的乙醇溶液，濾液于50mL的容量瓶中定容，即得其提取液。

1.3.3 金桂花中總黃酮提取率的計(jì)算 總黃酮提取率計(jì)算公式見式（1）。

式中：

R——金桂花中總黃酮提取率，%；

n——稀釋倍數(shù)；

c——總黃酮濃度，g/mL；

V——提取液的總體積，mL；

m——提取所用的金桂花粉干重，g。

1.3.4 微波輔助提取的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱取質(zhì)量恒重的金桂花粉末0.25g，分步確定以下各因素對(duì)金桂花中總黃酮提取率的影響。

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)：預(yù)設(shè)料液比1︰30（m︰V）、提取時(shí)間10×20s（提取10次，每次20s，每次間隔2min）、微波功率300W，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，45%，50%，55%，60%，65%時(shí)金桂花中總黃酮提取率的變化。

（2）料液比：預(yù)設(shè)提取時(shí)間10×20s，微波功率300W，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，分別考察料液比為1︰20，1︰25，1︰30，1︰35，1︰40，1︰45（m︰V）時(shí)金桂花中總黃酮提取率的變化情況。

（3）提取時(shí)間：預(yù)設(shè)微波功率300W，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，料液比1︰30（m︰V），分別考察提取時(shí)間為2×20 s，4×20s，6×20s，8×20s，10×20s，12×20s時(shí)金桂花中總黃酮提取率的變化情況。

（4）微波功率：設(shè)定提取時(shí)間10×20s，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，料液比1︰30（m︰V），分別考察微波功率為100，200，300，400，500，600W時(shí)金桂花中總黃酮提取率的變化。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，分別選取影響總黃酮提取率的乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、微波功率，開展四因素三水平的正交試驗(yàn)，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析得出各因素影響金桂花中總黃酮提取率的主次順序，進(jìn)而確定其最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 金桂花中總黃酮最大吸收波長(zhǎng)的確定 采用分光光度法于200～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描測(cè)定金桂花乙醇溶液的最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果顯示其在510.20nm處有明顯吸收峰，與所測(cè)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長(zhǎng)（510.00nm）基本一致，由此可確定金桂花中確含黃酮類化合物。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 按照1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，分別以蘆丁濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)、體系吸光度A為縱坐標(biāo)，經(jīng)一元線性回歸分析得回歸方程為A＝4.397 6C＋0.005 8（R2＝0.997 9），表明蘆丁乙醇溶液在0～0.04mg/mL范圍內(nèi)濃度C與吸光度A間具有良好的線性關(guān)系。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)金桂花中總黃酮提取率的影響

在植物花朵中黃酮類化合物多以苷類形式存在，其水溶性隨糖苷分子中糖基的增多和糖鏈的增長(zhǎng)而增強(qiáng)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于40%時(shí)，提取液中糖類成分含量多，離心后體系比較渾濁，嚴(yán)重影響總黃酮含量的測(cè)定及后期的精制純化；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于50%時(shí)，總黃酮提取率隨乙醇濃度的上升而逐步升高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，其提取效果最好，提取率最高，達(dá)17.45%；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增大，其提取率不升反降。由圖1可知，在此提取條件下，金桂花中總黃酮微波輔助提取工藝中乙醇體積分?jǐn)?shù)以50%最佳。

2.3 料液比對(duì)金桂花中總黃酮提取率的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)金桂花中總黃酮提取率的影響Figure 1 Effect of volume percentage of ethanol on extraction yield of flavones

料液比是有效成分提取時(shí)最重要的影響因素之一，料液比越大，固、液兩相濃度差越小，傳質(zhì)速率不高，有效成分萃取不完全；而隨液料比的減少，提取率會(huì)隨之增大。由圖2可知，隨料液用量的增加，總黃酮提取率逐步升高；當(dāng)料液比達(dá)到1︰35（m︰V）以后，其提取率漸趨平衡。綜合考慮到原料及后續(xù)進(jìn)一步精制提純的成本和工序的難易，在當(dāng)前提取條件下，以料液比1︰35（m︰V）為最佳。

圖2 料液比對(duì)金桂花中黃酮類化合物提取率的影響Figure 2 Effect of solid to liquid ratio on extraction yield of flavones

2.4 提取時(shí)間對(duì)金桂花中總黃酮提取率的影響

微波輔助提取是基于在微波產(chǎn)生的電磁場(chǎng)中不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)吸收微波能力的差異，從而使提取體系中的目的組分被選擇性地加熱，并從體系中分離進(jìn)入微波吸收能力相對(duì)較差的提取溶劑中［7，8］。微波所產(chǎn)生的電磁場(chǎng)可加速目的組分向萃取溶劑界面的擴(kuò)散，使目的組分能在較低溫度下以較快的速度被萃取出來，可最大限度地保證萃取的質(zhì)量［9］。由圖3可知，間歇式微波輔助提取的時(shí)間在2×20s～8×20s（提取2～8次，每次20s，每次間隔2min）時(shí)，隨微波輔助提取時(shí)間的延長(zhǎng)，金桂花中總黃酮提取率不斷增大，此后，隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)總黃酮提取率呈下降趨勢(shì)?？赡苁牵瑫r(shí)間過短時(shí)，反應(yīng)所產(chǎn)生的微波輻射能尚不足以引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變和細(xì)胞膜電位的變化，導(dǎo)致黃酮類化合物的溶出受阻；當(dāng)輔助提取時(shí)間過長(zhǎng)則乙醇揮發(fā)嚴(yán)重，也影響了黃酮類化合物的溶出。因此，在當(dāng)前提取條件下，從時(shí)間效益角度考慮，提取時(shí)間以8×20s為宜。

圖3 提取時(shí)間對(duì)金桂花中總黃酮提取率的影響Figure 3 Effect of extraction time on extraction yield of flavones

2.5 微波功率對(duì)金桂花中總黃酮提取率的影響

由圖4可知，微波功率在100～300W時(shí)，提取率隨微波功率的增大呈上升趨勢(shì)，當(dāng)功率超過300W時(shí)，隨著微波功率的上升，金桂花中總黃酮提取率反呈下降趨勢(shì)，有可能是因?yàn)樵诋?dāng)前微波功率條件下，部分黃酮類化合物在微波的熱效應(yīng)作用下分解與破壞，從而導(dǎo)致提取率下降，因此，在當(dāng)前提取條件下，選擇微波功率300W為宜。

圖4 微波功率對(duì)金桂花中總黃酮提取率的影響Figure 4 Effect of microwave power on extraction yield of flavones

2.6 正交試驗(yàn)

試驗(yàn)因素水平取值見表1，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，根據(jù)各因素極差R的大小可判斷得出，影響微波輔助提取金桂花中總黃酮提取率的因素主次順序依次為B（提取時(shí)間）＞C（料液比）＞A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞D（微波功率），表2中最佳提取工藝組合為A1B2C2D2，其總黃酮提取率為19.45%。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析發(fā)現(xiàn)，各因素水平的最佳組合是A2B2C2D2，因在表2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中并無該組合，故需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。稱取金桂花粉末0.25g，以A2B2C2D2中各因素水平開展試驗(yàn)，重復(fù)5次，得金桂花中總黃酮的平均提取率為20.30%。由此可見，微波輔助提取金桂花中總黃酮的最優(yōu)工藝組合為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1︰35（m︰V）、提取時(shí)間8×20s、微波功率300W。

本試驗(yàn)的正交表各列除因子列外，無空列設(shè)置，旨在確定各因素對(duì)金桂花中總黃酮提取率影響的差異，特征性地將偏差平方和最小項(xiàng)（D項(xiàng)）視作誤差項(xiàng)，則誤差自由度可視為2（表3中誤差行括號(hào)內(nèi)數(shù)值分別被視作誤差偏差平方和與誤差自由度），由此可依次計(jì)算出各因子列的F值，方差分析具體結(jié)果見表2，提取時(shí)間和料液比對(duì)總黃酮提取率的影響顯著（P＜0.05），而乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率對(duì)提取率的影響甚微。

表1 試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

表2 金桂花中總黃酮微波輔助提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 2 Design and result analysis of orthogonal tests for extraction optimization of flavones

3 討論與結(jié)論

微波輔助提取法是利用微波能提高動(dòng)植物中有效成分提取效率的一種新技術(shù)［10］，具有得率高、選擇性大、易控溫、加熱快等一系列優(yōu)點(diǎn)［11－13］，且微波提取設(shè)備的尺寸不大、提取過程中溶劑消耗不高、提取過程中無污染能源的利用，且廢物產(chǎn)生及對(duì)產(chǎn)品的污染少［9，13］。本試驗(yàn)綜合運(yùn)用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了影響微波輔助提取金桂花中總黃酮提取率的因素主次順序，即提取時(shí)間＞料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波功率；優(yōu)化得出了微波輔助提取金桂花中總黃酮的最佳工藝條件：提取時(shí)間8×20s（提取8次，每次20s，每次時(shí)間間隔2min）、料液比1︰35（m︰V）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、微波功率300W，在此條件下總黃酮的提取率達(dá)20.30%，與朱沛沛等［6］的研究相比，在微波功率和料液比相同、乙醇體積分?jǐn)?shù)相當(dāng)?shù)臈l件下，通過連續(xù)提取與間歇提取方式的變換，金桂花中總黃酮提取率提高22.21%（16.61%vs.20.30%），對(duì)微波輔助提取總黃酮工藝條件的完善提供了新的技術(shù)支持。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

1 馬博，張婷婷，黎遠(yuǎn)成，等.麻瘋樹籽殼總黃酮的提取及其羥基自由基清除作用［J］.食品與機(jī)械，2014，30（5）：202～205，211.

2 文開新，王文章，嚴(yán)學(xué)兵，等.黃酮類化合物生物學(xué)活性研究進(jìn)展［J］.草業(yè)科學(xué)，2010，27（6）：116～119.

3 徐懷德.天然產(chǎn)物提取工藝學(xué)［M］.北京：中國(guó)輕工出版社，2009：338～353.

4 Mandal V，Dewanjee S，Mandal S C.Microwave－assisted extraction of total bioactive saponin fraction fromGymnema sylvestrewith reference to gymnemagenin：apotential biomarker ［J］.Phytochem Anal，2009，20（6）：491～497.

5 駱健美，盧學(xué)英，張敏卿.微波萃取技術(shù)及其應(yīng)用［J］.化工進(jìn)展，2001，12（5）：46～49.

6 朱沛沛，梁晶，李寧寧.桂花總黃酮的微波輔助提取工藝研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，2012，37（8）：40～42，55.

7 李揚(yáng)，趙樹法，李婷，等.微波輔助萃取技術(shù)在食品工業(yè)中的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)釀造，2006（9）：5～8.

8 Song Jing－Zheng，Mo Shi－Fu，Yip Yue－Keung，et al.Development of microwave assisted extraction for the simultaneous determination of isoflavonoids and saponins inradix astragaliby high performance liquid chromatography［J］.J.Sep.Sci.，2007，30（6）：819～824.

9 周泉城，區(qū)穎剛，申德超.微波輔助提取擠壓后大豆皂苷工藝研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2008，23（5）：42～45.

10 隋大鵬.枇杷葉熊果酸微波輔助提取工藝的優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2013，29（5）：164～166，174.

11 周海旭，李忠海，鐘海雁，等.微波輔助乙醇提取樟樹葉多酚工藝優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2013，29（5）：167～169，209.

12 馬萍，郭希娟，郭增旺.黑米黑色素微波輔助提取工藝優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2014，30（5）：235～237.

13 王建輝，劉永樂，李赤翎，等.絲蘭皂甙的微波輔助提取工藝研究［J］.食品科學(xué)，2012，33（2）：58～62.