探頭式超聲乳化催化脂肪酶TLIM水解茶葉籽油工藝優(yōu)化

向小樂 余 佶 楊萬根 麻成金（1.吉首大學林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 47000；.吉首大學食品科學研究所，湖南 吉首 416000）

脂肪酶催化油脂水解因具有反應條件溫和、效率高、產(chǎn)物雜質(zhì)少等優(yōu)勢而成為制備甘油二酯、甘油單脂、脂肪酸、結構脂質(zhì)及油脂深加工的有效手段［1，2］。超聲波的空化、乳化效應較強，能降低界面張力和溶液黏度、增加非均相之間接觸界面，從而促進油脂酶解［3，4］。

近年來，國內(nèi)外對茶葉籽油的研究主要集中于提取精煉工藝、脂肪酸組成［5］、理化特性、保健功能［6］等方面，暫無運用探頭式超聲波對油脂酶解工藝進行強化處理的文獻報道。本試驗在前期研究［7］的基礎上，擬采用Box－Benhnken試驗設計，對探頭式超聲波耦合磁力攪拌協(xié)同輔助脂肪酶TLIM，催化茶葉籽油水解工藝條件進行優(yōu)化，以期進一步為茶葉籽油的綜合加工利用及脂肪酶TLIM的酶學性質(zhì)研究提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉籽油：由湖南省古丈縣茶葉基地提供茶葉籽，機械壓榨制油；

脂肪酶：TLIM（250IU/g），諾維信生物技術有限公司；

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、無水乙醇等：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

超聲波細胞破碎機：JY92－IIDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

雙數(shù)顯恒溫測速磁力攪拌器：85－2A型，金壇市白塔新寶儀器廠；

電子天平：FA2004型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶葉籽油酶解 在文獻［7］的基礎上加以改進，將所需配比的茶葉籽油、TLIM脂肪酶及pH緩沖液于30mL反應釜中混勻，調(diào)節(jié)水浴溫度、磁力攪拌轉速，設置超聲波發(fā)生器參數(shù)，開始反應。反應結束后，直接測定茶葉籽油酶解產(chǎn)物——油水乳化液酸值。

1.2.2 水解率計算 參照 GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》測定油水乳化液酸值，參照GB/T 5534—2008《動植物油脂皂化值的測定》測定茶葉籽油皂化值。酸值［8］及水解率［2，3］分別按式（1）和（2）計算：

式中：

AV——乳化油樣酸值，mg KOH/g；

CKOH——氫氧化鉀濃度，mol/L；

V滴——滴定油樣所耗氫氧化鉀，mL；

V空——對照試驗所耗氫氧化鉀，mL；

MKOH——KOH 摩爾質(zhì)量，g/mol；

m樣——所取乳化液質(zhì)量，g；

fo——乳化液中油所占質(zhì)量分數(shù)。

式中：

DH——茶葉籽油水解率，%；

SV——皂化值，mg KOH/g；

AV0、AVt——分別表示酶解前后酸值，mg KOH/g。

1.2.3 單因素試驗設計

（1）超聲波功率：固定油水比1︰1.5（m︰V），攪拌轉速600r/min，脂肪酶TLIM濃度1.0%（油重），溫度50℃，緩沖液初始pH 6.5，時間2h，研究超聲波功率（20，80，140，200，260，320，380W，空占比＝1s︰2s）對茶葉籽油酶解的影響。

（2）攪拌轉速：固定油水比1︰1.5（m︰V），超聲波功率320W，脂肪酶TLIM濃度1%，溫度50℃，pH 6.5，時間2h，研究攪拌轉速（200，400，600，800，1 000，1 200r/min）對茶葉籽油酶解率的影響。

（3）酶解溫度：固定油水比1︰1.5（m︰V），超聲波功率320W，轉速800r/min，脂肪酶 TLIM 濃度1%，pH 6.5，時間2h，研究水浴溫度（35，40，45，50，55，60，65℃）對茶葉籽油酶解率的影響。

（4）脂肪酶TLIM濃度：固定油水比1︰1.5（m︰V），超聲波功率320W，轉速800r/min，溫度50℃，pH 6.5，時間2h，研究脂肪酶 TLIM 濃度（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%）對茶葉籽油酶解率的影響。

（5）緩沖液初始pH：固定油水比1︰1.5（m︰V），超聲波功率320W，轉速800r/min，溫度50℃，脂肪酶濃度2.5%，時間2h，研究緩沖液初始pH（6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5）對茶葉籽油酶解率的影響。

（6）酶解時間：固定油水比1︰1.5（m︰V），超聲波功率320W，轉速800r/min，溫度50℃，脂肪酶TLIM濃度2.5%，pH 8.5，研究酶解時間（0，2，4，6，8，10，12，14h）對茶葉籽油酶解率的影響。

1.2.4 響應面優(yōu)化設計 本試驗在單因素試驗結果的基礎上，以茶葉籽油水解率為響應值，運用 minitab.16中Box－Benhnken設計四因素三水平響應面分析試驗對超聲波輔助脂肪酶TLIM水解茶葉籽油工藝進行優(yōu)化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗數(shù)據(jù)使用Origin 8軟件進行分析，響應面試驗數(shù)據(jù)使用minitab.16軟件進行分析，每組試驗設計3個平行。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲波功率對茶葉籽油水解率的影響 由圖1可知，茶葉籽油水解率隨超聲波功率的增加先呈指數(shù)型增長而后變緩，這與馬歌麗等［9］報道的超聲波對脂肪酶酶學特性的影響所得結論相似。此結果表明，適當功率的超聲波強化能促進脂肪酶催化茶葉籽油水解，其原因可能是超聲波的乳化效應能增大反應底物油水之間的接觸面積、空化效應能促使產(chǎn)物釋放［3］。因此，綜合考慮超聲波的催化效率及儀器的使用壽命，選擇超聲波功率為320W為宜。

圖1 超聲波功率對茶葉籽油水解率的影響Figure 1 Effect of power of ultrasonic on tea seed hydrolysis

圖2 磁力攪拌轉速對茶葉籽油水解的影響Figure 2 Effect of speed of magnetic stirring on Tea seed hydrolysis

2.1.2 磁力攪拌轉速對茶葉籽油水解率的影響 由圖2可知，當攪拌轉速小于800r/min時，茶葉籽油水解率隨轉速增加而增大，當攪拌轉速大于1 000r/min時其水解率反而有所降低。其原因可能是增大攪拌轉速能有效加大油水接觸界面，而轉速過高又可能破壞酶蛋白結構［10］；此外，也可能是由于當轉速高于1 000r/min后，磁力攪拌的磁子不穩(wěn)定而導致茶葉籽油水解率降低。因此，選擇磁力攪拌轉速在800r/min左右為宜。

2.1.3 酶解溫度對茶葉籽油水解率的影響 由圖3可知，在該酶解體系中，脂肪酶TLIM催化茶葉籽油水解反應的最適溫度為50℃，這與向小樂等［7］、高巍等［11］所得結論相近。因此，選擇酶解溫度在50℃左右為宜。

圖3 酶解溫度對茶葉籽油水解率的影響Figure 3 Effect of bath temperature on tea seed hydrolysis

2.1.4 脂肪酶TLIM濃度對茶葉籽油水解率的影響 由圖4可知，在該試驗范圍內(nèi)，茶葉籽油水解率隨脂肪酶TLIM濃度的增加先急速增長，當其濃度達2.5%后水解增長放緩，說明脂肪酶基本飽和。與文獻［7］相比，此酶解體系的脂肪酶濃度稍低于機械攪拌聯(lián)合超聲波震浴酶解體系的飽和濃度，說明探頭式超聲波乳化促進了脂肪酶溶解及其與油水乳化液的結合。因此，綜合考慮水解效率及脂肪酶成本，選擇脂肪酶TLIM濃度在2.5%左右為宜。

圖4 脂肪酶TLIM濃度對茶葉籽油水解率的影響Figure 4 Effect of concentration of lipase TLIM on tea seed hydrolysis

2.1.5 pH對茶葉籽油水解率的影響 酶促反應最適pH由酶分子本質(zhì)特性及外界環(huán)境酸堿度共同決定，即反應體系中酸堿度可通過改變酶分子表面電荷及酶蛋白構象來影響酶的催化活性［12，13］。由圖5可知，脂肪酶TLIM催化茶葉籽油水解反應的最適pH為8.5，說明TLIM是一種堿性脂肪酶，與向小樂等［7］所得結論基本一致。

圖5 緩沖液初始pH對茶葉籽油水解率的影響Figure 5 Effect of initial pH of buffer on tea seed hydrolysis

2.1.6 酶解時間對茶葉籽油水解率的影響 由圖6可知，在該酶解體系中，反應8h左右即可使水解率達70%左右（理論水解率為66.67%，水解率高于66.67%的原因可能是2位上脂肪酸異構到1，3位來參與反應［14，15］，因此水解速率增長大幅下降）。與文獻［7］中機械攪拌聯(lián)合超聲波震浴輔助茶葉籽油酶解17h方可使水解率達到70%相比，探頭式超聲波乳化工藝的水解效率顯著提高。因此，綜合考慮水解程度及酶解效率，選擇酶解時間為8h為宜。

圖6 酶解時間對茶葉籽油水解率的影響Figure 6 Effect of reaction time on tea seed hydrolysis

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗設計及結果 Box－Benhnken響應面試驗設計因素及水平見表1，結果及預測值見表2、方差分析見表3。運用軟件minitab.16對表2中試驗結果進行回歸分析，得預測模型方程：

表1 Box－Benhnken設計水平編碼表Table 1 Variables and coded levels used in the B－BD

表2 Box－Benhnken響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box－Benhnken Design

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由表3可知，所建模型P＜0.05（顯著），相關系數(shù)R2＝0.944 8，決定系數(shù)（調(diào)整相關系數(shù)）＝0.845 3，失擬項P＝0.096＞0.05（不顯著），說明該模型擬合程度較高，能在84.53%的變更范圍內(nèi)解釋茶葉籽油的酶解情況［16］；試驗因子對茶葉籽油酶解的影響順序為TLIM脂肪酶濃度＞溫度＞轉速。

2.2.2 因素交互作用 根據(jù)方差分析結果，利用軟件minitab.16對茶葉籽油酶解影響較大的兩交互因子進行響應面分析，結果見圖7、8。響應曲面的陡度和等高線與坐標軸交點數(shù)能在一定程度上反映試驗因子對響應值的貢獻大小。

由圖7、8可知，試驗因素曲面陡度及其等高線與坐標軸的交點數(shù)大小順序為B＞A＞C，即說明各試驗因子對超聲波輔助TLIM脂肪酶催化茶葉籽油水解影響的大小順序：脂肪酶TLIM濃度＞溫度＞轉速，此結論與方差分析結果一致。綜合考慮反應效率和經(jīng)濟效益對茶葉籽油酶解工藝進行優(yōu)化，結果見2.2.3。

2.2.3 優(yōu)化工藝確定和驗證實驗 運用軟件minitab.16中響應優(yōu)化器對A、B、C三因素進行尋優(yōu)處理，結果見圖9。

圖7 A—B因素交互作用的響應面及等高線圖Figure 7 Response surface and contour plot for the interaction of A and B

圖8 A—C因素交互作用的響應面及等高線圖Figure 8 Response surface and contour plot for the interaction of A and C

圖9 響應因子優(yōu)化圖Figure 9 optimizingfigure of response test factor

由圖9可知，超聲波耦合磁力攪拌協(xié)同輔助脂肪酶TLIM水解茶葉籽油的優(yōu)化工藝為：A＝0.090 9，B＝1.000 0，C＝0.212 1，經(jīng)編碼公式轉換為實際參數(shù)值：溫度為50.45℃，TLIM脂肪酶濃度為3.0%，轉速為842.42r/min?？紤]實際情況，選?。簻囟?0.5℃，TLIM脂肪酶濃度3.0%，轉速840r/min進行3次平行驗證實驗，測得茶葉籽油的平均水解率為73%，與模型預測值73.38%的相對標準偏差為0.52%。說明在本試驗范圍內(nèi)，所建模型擬合程度較好，預測能力較強。

3 結論

探頭式超聲波耦合磁力攪拌協(xié)同輔助脂肪酶TLIM催化茶葉籽油水解的優(yōu)化工藝條件為：超聲波功率320W，攪拌轉速840r/min，酶解溫度50.5℃，脂肪酶TLIM濃度3.0%，緩沖液初始pH 8.5，酶解時間8h，在該條件下茶葉籽油水解率約達73%。與機械攪拌聯(lián)合超聲波震浴（清洗器）酶解體系［7］相比，此法酶解8h左右即可完成脂肪酶TLIM催化茶葉籽油水解的主體反應（選擇性水解1，3位上脂肪酸，理論水解率67%），催化效率高，操作簡便易行。但該法酶解增大了反應產(chǎn)物——油水乳化混合液的分離難度。

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