油茶葉中黃酮的超聲輔助提取及其抗氧化活性研究

曹清明 鄔靖宇 鐘海雁 包莉圓 孫亞娟（.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 40004；2.經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 40004）

油茶葉富含黃酮類化合物［1，2］，其黃酮類物質(zhì)的母核主要為山奈酚［3］和槲皮素［1，3］，且與之結(jié)合的糖基主要是鼠李糖、半乳糖和葡萄糖［3］。油茶葉黃酮提取物具有抗氧化［4］、抑菌［5，6］、防腐保鮮［7］和降血脂［8］等功能作用。每年4、5月間油茶樹打葉產(chǎn)生大量的落葉，但目前此類資源仍未得到有效利用。從油茶葉中提取黃酮類化合物，可提高油茶資源的綜合利用率。

超聲輔助提取可在較低溫度下高效率地萃取物質(zhì)中的活性成分［9，10］，用超聲輔助從油茶葉中提取黃酮的研究也有報道，但往往存在溶劑消耗量大、耗時、耗能等缺點。如：張建良等［1］利用甲醇從油茶葉中提取得到了黃酮；李姣娟等［4］以體積分數(shù)為60%的乙醇為提取劑，在固液比1︰20（m︰V），提取溫度80℃，提取2次，每次提取2h的條件下提取油茶葉黃酮，其得率為48.7mg RE/g；肖新生等［11］采用超聲波輔助萃取法，在乙醇濃度60%，提取時間20min，料液比1︰20（m︰V），超聲波功率450W的條件下得到的粗黃酮得率為4.17%；黃陳陳［6］選用超聲波輔助提取與有機溶劑萃取相結(jié)合的方法，采用正交試驗方法確定了油茶葉黃酮最佳提取條件，即在料液比1︰20（m︰V）時以75%乙醇為提取劑，在75℃溫度下萃取70min，黃酮得率為46.82mg RE/g。李姣娟等［4］的方法盡管得率最高，但其所用的時間長，提取溫度高；肖新生等［11］的方法得率較低；黃陳陳［6］的提取方法使用有機溶劑乙醇濃度大，為了克服上述不足，本研究擬對油茶葉黃酮的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化，并對其提取物進行抗氧化能力試驗，旨為油茶葉的綜合開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料

新鮮油茶葉：采自湖南省天際嶺國家森林公園，由中南林業(yè)科技大學(xué)譚曉鳳教授鑒定為普通油茶（Camellia Oleif－era Abel.）。

1.1.2 試劑蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：HPLC純，純度＞97%，美國Sigma公司；1，1－二苯基－2－苦味酰基苯肼（DPPH）：HPLC純，美國Sigma公司；

2 ，2－聯(lián) 氮－二 （3－乙 基－苯 并 噻 唑－6－磺 酸 ）二 銨 鹽（ABTS）：美國Sigma公司。

1.1.3 儀器

721可見分光光計，A－1402017型，上海菁華科技儀器有限公司；

旋風(fēng)式樣品磨：FOSS CT410型，蘇州安創(chuàng)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R－205B型，上海申勝儀器公司；

恒溫水浴鍋：DZKW－S－8型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；

超聲波清洗器：AS10200A型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2 油茶葉黃酮類化合物的提取

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 準(zhǔn)確稱取0.007 2g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用50%乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至50mL棕色容量瓶，用50%乙醇定容，即得144μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)母液。分別取蘆丁母液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL至5個25mL棕色容量瓶中，分別向容量瓶中加入質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO20.6mL，搖勻后靜置6min，往各容量瓶中加入質(zhì)量分數(shù)為10%的Al（NO3）30.6mL，搖勻后放置6min，加入1mol/L的 NaOH溶液8mL，用50%乙醇溶液定容，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度依次為11.52，23.04，34.56，46.08，57.60μg/mL。將配好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液靜置15min，于510nm波長處測吸光值，并以50%乙醇水溶液做參比。根據(jù)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 油茶葉黃酮類物質(zhì)的提取 稱取5.000g自然陰干的油茶葉粉末，加入一定體積的乙醇—水提取液。放入超聲波清洗機（功率為300W）內(nèi)進行超聲輔助提取。提取一定時間后用定性濾紙過濾獲得上清液，重復(fù)提取若干次，合并所得上清液，濃縮定容至250mL即為黃酮提取溶液。

1.2.3 油茶葉中黃酮提取率的測定 取1.2.2獲得的黃酮提取液5mL于25mL容量瓶中，加質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO20.6mL，搖勻后靜置6min，加入質(zhì)量分數(shù)為10%的Al（NO3）30.6mL，搖勻后放置 6min，加入 1mol/L 的NaOH溶液8mL，用50%乙醇溶液定容，15min后于510 nm處測定吸光值。以50%乙醇水溶液做參比。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、稀釋倍數(shù)、樣品質(zhì)量得到總黃酮提取量，并按式（1）計算黃酮類化合物的提取量。黃酮提取量以與等量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（rutin equivalent，RE）相當(dāng)?shù)纳锘钚杂嫛?/p>

式中：

P——油茶葉黃酮的提取量，mg RE/g；

C——通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的黃酮濃度，μg/mL；

V——黃酮提取物的體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

m——油茶葉樣品的質(zhì)量，g。

1.3 油茶葉黃酮類物質(zhì)提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)前期單因素試驗的結(jié)果，選擇超聲處理時間、料液比、提取溫度、乙醇濃度為試驗因素，以黃酮提取量作為優(yōu)化指標(biāo)，進行L9（34）的正交試驗。正交試驗因素水平見表1。

表1 因素水平Table 1 Levels of factors

1.4 油茶葉中黃酮類物質(zhì)的抗氧化能力

以優(yōu)化工藝得到的提取液作為原液，按其黃酮含量用蒸餾水稀釋成10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μg RE/mL，將不同濃度的黃酮提取液進行DPPH·和ABTS＋自由基清除試驗；按其黃酮含量用蒸餾水稀釋成100，200，300，400，500，600，700，800，900，1 000μg RE/mL，將不同濃度的黃酮提取液進行羥自由基清除試驗。

1.4.1 DPPH·清除能力 根據(jù)文獻［12］的方法，略作修改：精密稱取19.716mg DPPH粉末，用無水乙醇配制成1×10－4mol/L的DPPH·乙醇溶液。量取不同濃度的黃酮樣液1mL，加入DPPH·乙醇溶液3mL，混勻，室溫下避光15 min，以無水乙醇調(diào)零，517nm處測量吸光值為A1，以無水乙醇代替黃酮樣液測定吸光值為A0，無水乙醇代替D PPH·乙醇溶液測定吸光值為A2。按上述方法測定相同濃度的沒食子酸、BHT、Vc的DPPH·清除率，比較提取樣液與BHT、Vc的DPPH·清除能力。每組試驗重復(fù)3次。DPPH·清除率按式（2）計算：

式中：

C——DPPH·清除率，%；

A1——各濃度黃酮提取液與DPPH·乙醇溶液反應(yīng)后的吸光值；

A2——無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液反應(yīng)后的吸光值；

A0——無水乙醇代替黃酮樣液與DPPH·乙醇溶液反應(yīng)后的吸光值。

1.4.2 ABTS＋清除能力 根據(jù)文獻［13］的方法，略作修改：將7mmol/L的 ABTS和2.45mmol/L的過硫酸鉀溶液，按體積比1︰2混合，在4℃冰箱中靜置16～18h，制得ABTS＋儲備液。將儲備液用無水乙醇稀釋成在734nm波長處吸光值為0.700±0.020的工作液。準(zhǔn)確量取0.1mL不同濃度（10～100μg/mL）的黃酮樣液于10mL試管中，同時向試管中加入ABTS＋工作液2.9mL，常溫下避光反應(yīng)6 min后，測定734nm波長處的吸光值A(chǔ)1；蒸餾水代替黃酮樣液，測定吸光值A(chǔ)0；蒸餾水代替ABTS＋工作液，測定吸光值A(chǔ)2。用上述方法測定相同濃度的BHT、Vc的ABTS＋清除率，比較油茶葉提取液與沒食子酸、BHT、Vc的ABTS＋清除能力。每組試驗重復(fù)3次。ABTS＋清除率按式（3）計算：

式中：

C——ABTS＋清除率，%；

A1——各濃度黃酮提取液與ABTS＋工作液反應(yīng)后的吸光值；

A2——無水乙醇代替ABTS＋工作液反應(yīng)后的吸光值；

A0——無水乙醇代替黃酮樣液與ABTS＋工作液反應(yīng)后的吸光值。

1.4.3 ·OH清除能力 用移液槍移取6mmol/L的硫酸亞鐵溶液和6mmol/L的過氧化氫溶液各1mL于離心管中，將兩者混合均勻后向混合溶液中加入1mL不同濃度的提取液（0.1～1.0mg/mL），靜置10min，加入6mmol/L水楊酸溶液1mL，37℃水浴震蕩30min，4 000r/min離心10 min，得上清液，將上清液于510nm波長處測定吸光值A(chǔ)1；蒸餾水代替樣品液，測定吸光值A(chǔ)0；蒸餾水代替水楊酸，測定吸光值A(chǔ)2。用上述方法測定相同濃度的蘆丁、BHT、Vc的·OH清除率，比較油茶葉提取液與BHT、Vc的·OH清除能力。每組試驗重復(fù)3次。·OH清除率按式（4）計算：

式中：

C——·OH清除率，%；

A1——各濃度黃酮提取液與·OH反應(yīng)后的吸光值；A2——無水乙醇代替水楊酸反應(yīng)后的吸光值；

A0——無水乙醇代替黃酮樣液與·OH反應(yīng)后的吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，回歸方程的擬合用Excel完成，方差分析使用SPSS 17.0。以P＜0.05作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的確定

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Rutin standard curve

蘆丁的濃度與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為y＝0.014 6x，R2＝0.999 1（x為總黃酮濃度，μg/mL；y為吸光值），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.00～57.60μg/mL濃度范圍內(nèi)，濃度與吸光值存在良好線性關(guān)系，該線性方程可以用來測定提取液中黃酮類化合物的含量。

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

選擇超聲處理時間、料液比、提取溫度、乙醇濃度4個因素進行正交試驗優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiments（n＝3）

由表2可知，在9次正交試驗中以第5次試驗中黃酮提取量最多，為46.93mg RE/g，第8次試驗黃酮提取量最少，為39.08mg RE/g。直觀分析表明超聲處理時間、料液比、提取溫度和乙醇濃度4個因素對黃酮提取量的影響大小次序為：乙醇濃度＞超聲處理時間＞料液比＞提取溫度。綜合各因素的k值和極差R比較，得出超聲輔助提取法的最佳工藝條件為A2B2C2D1，即超聲處理時間30min，料液比1∶20（m︰V），提取溫度70℃，乙醇濃度50%。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

由表3可知，超聲處理時間、料液比和乙醇濃度3個因素的不同水平對黃酮提取率的影響極顯著（P＜0.01），提取溫度對黃酮提取率的影響顯著（P＜0.05）。由表4可知，選擇超聲處理時間30min，料液比1︰20（m︰V），提取溫度70℃，乙醇濃度50%，可取得最佳提取效果。綜合考慮各因素，得出超聲輔助提取法上的最佳工藝條件為A2B2C2D1。比較正交試驗的極差分析和方差分析結(jié)果，可以得出相同的結(jié)論。

表4 因素各水平結(jié)果的多重比較Table 4 Multiple comparison results of different levels of Factors

表4 因素各水平結(jié)果的多重比較Table 4 Multiple comparison results of different levels of Factors

同列不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。

A/min黃酮提取率/（mg RE·g－1）B（m︰V）黃酮提取率/（mg RE·g－1）C/℃黃酮提取率/（mg RE·g－1）D/%黃酮提取率/（mg RE·g－1）20 42.14±2.43b 30 44.45±2.68a 40 41.15±1.99c 1︰15 41.47±0.93c 1︰20 43.56±3.51a 1︰25 42.70±2.79b 65 42.33±2.80b 70 43.04±1.69a 75 42.37±3.53b 50 44.28±2.11a 60 43.69±2.13b 70 39.77±1.00c

對選擇的最佳提取方案A2B2C2D1，即超聲處理時間30 min，料液比1︰20（m︰V），提取溫度70℃，乙醇濃度50%，進行驗證實驗，采用 NaNO2—Al（NO3）3—NaOH 比色法測定黃酮含量，獲得的提取率為47.01mg RE/g。結(jié)果與正交試驗方案中的試驗號為5的結(jié)果（46.93mg RE/g）基本一致，說明正交試驗所獲最佳方案的準(zhǔn)確性。

2.3 油茶葉黃酮的抗氧化能力

2.3.1 DPPH·清除能力 DPPH·具有自由電子，有強氧化性，易被抗氧化劑還原。由圖2可知，提取物、VC均具有很強的DPPH·清除能力，BHT的清除能力相對較差。前兩者在較低濃度時清除率就達到90%，超過該濃度（約30μg/mL）后DPPH·清除率變化趨于平衡。選用濃度為0，10，20，30 μg/mL 4個點進行線性擬合，由Excel擬合出油茶葉黃酮濃度與DPPH·清除率的回歸擬合方程為y＝3.307 6x（R2＝0.913 5），將y＝50代入該方程，求得半數(shù)自由基清除值（IC50）為15.12μg/mL。

圖2 不同濃度的提取物、BHT、VC的DPPH·清除率Figure 2 The DPPH free racial－scavenging capacity of Extract，BHT ＆ VCin different concentrations

2.3.2 ABTS＋清除能力 ABTS＋可以與抗氧化劑反應(yīng)褪去顏色，試驗通過向反應(yīng)器中加入不同濃度的提取物、VC及BHT，根據(jù)反應(yīng)器中顏色的減弱情況來計算自由基的清除率。由圖3可知，樣品、VC及BHT均具有ABTS＋清除能力，且其清除能力與濃度呈正相關(guān)。相同濃度的3種物質(zhì)中BHT清除率最低。在整個試驗濃度范圍內(nèi)油茶葉提取物的ABTS＋清除率均高于BHT的清除率，但低于VC的清除率。由Excel擬合出油茶葉提取物濃度與ABTS＋清除率的回歸擬合方程為y＝2.364x（R2＝0.989），將y＝50代入該方程，求得半數(shù)自由基清除值（IC50）為21.15μg/mL。

圖3 不同濃度提取物、BHT、VC的ABTS＋清除率Figure 3 The ABTS free radical－scavenging capacity of Extract，BHT ＆ VCin different concentrations

2.3.3 ·OH清除能力 H2O2能與Fe2＋發(fā)生Fenton反應(yīng)生成活性很強的·OH，·OH能殺死紅細胞，降解DNA、細胞膜和多糖化合物，對人體有一定的危害作用。本試驗以VC及BHT對參照探究油茶葉黃酮提取物對該自由基的清除效果。由圖4可知，3種物質(zhì)都具有一定的·OH清除能力，隨著濃度的增加，·OH清除率增加，當(dāng)濃度達到某一值后清除率趨于穩(wěn)定。各個濃度提取樣品的·OH清除率都比BHT高，與VC相當(dāng)。由Excel擬合出油茶葉黃酮濃度與·OH清除率的回歸擬合方程為y＝0.122x（R2＝0.944），將y＝50代入該方程，求得半數(shù)自由基清除值（IC50）為410.00μg/mL。

圖4 不同濃度提取物、BHT、VC清除羥自由基能力Figure 4 The Hydroxyl free racial－scavenging capacity of Extract，BHT ＆ VCin different concentrations

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了油茶葉黃酮的超聲提取工藝，其最優(yōu)工藝條件為：以50%乙醇溶液為提取劑，料液比1︰20（m︰V），提取溫度70℃，超聲功率300W，提取2次，每次30min，該條件下總黃酮得率為47.01mg RE/g。說明試驗采用正交分析法優(yōu)化油茶葉中總黃酮的提取具有實際可行性，可為油茶葉的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。該結(jié)果比肖新生等［11］（4.17%）和黃陳陳［6］（46.82mg RE/g）的高，原因可能與采收期、粉碎粒徑等有關(guān)，還需進一步的研究。本試驗中采用的微波功率為300W，乙醇濃度為50%，與肖新生等［11］的（450W和60%乙醇）相比，節(jié)省了能量和有機溶劑，與黃陳陳［6］的（75%乙醇）節(jié)省了有機溶劑。

體外抗氧化試驗表明，油茶葉黃酮有很強的DPPH·、ABTS＋及·OH 清除活性，IC50分別為15.12，21.15，410.00μg RE/mL。對于其活性的深入研究可以考慮進行動物試驗。

隨著油茶葉研究的不斷深入，多種萃取方法聯(lián)用，其提取率將大大提高，且節(jié)能環(huán)保。油茶葉黃酮提取物可以作為新型的天然食品防腐劑加以開發(fā)利用，不僅可以減少對環(huán)境的污染，還可以提高油茶業(yè)的收入。

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