飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)生長(zhǎng)、體成分、組織硒含量及相關(guān)酶活性的影響

許明珠 張 琴 童 潼 董蘭芳 楊家林 蔣 艷 黃國(guó)強(qiáng)

(廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北海 536000)

硒(selenium)是維持水產(chǎn)動(dòng)物正常生長(zhǎng)及生理功能的必需微量元素之一［1］，是生物體多種酶和蛋白質(zhì)的重要組成成分。硒具很強(qiáng)的生物活性，參與多種生理生化作用［2］。動(dòng)物飼料中補(bǔ)充硒的形式主要有2類(lèi):無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒。無(wú)機(jī)硒主要有單質(zhì)硒、亞硒酸鈉和硒酸鈉等，有機(jī)硒主要有蛋氨酸硒、酵母硒和硒多糖等。近年來(lái)有機(jī)硒在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，在畜牧業(yè)和漁業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用日益廣泛［3］。

方格星蟲(chóng)是一種無(wú)脊椎動(dòng)物，以吞食沙子消化其表面的有機(jī)物質(zhì)及藻類(lèi)來(lái)提供自身的能量，它對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高，一旦污染則不能成活［4］。同時(shí)方格星蟲(chóng)具有較高的食用價(jià)值，其粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)73.77%(干物質(zhì)基礎(chǔ))，而粗脂肪含量才0.67%(干物質(zhì)基礎(chǔ))，還含有鈉、鉀、磷、鐵、鎂、鈣、錳、鋅、銅等礦物質(zhì)元素和水溶性、脂溶性維生素［5］。近些年，許多學(xué)者對(duì)方格星蟲(chóng)的動(dòng)物形態(tài)解剖、繁殖及胚胎發(fā)育、動(dòng)物生理生化以及營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面都有比較全面的研究［4－17］。

硒元素在水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中具有重要的作用，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中對(duì)硒的營(yíng)養(yǎng)性研究才剛剛起步，對(duì)飼料中的有關(guān)微量元素，尤其是微量元素硒對(duì)方格星蟲(chóng)的生長(zhǎng)與體組成的報(bào)道還比較少，為了探究有關(guān)這方面的內(nèi)容，本試驗(yàn)研究了硒元素對(duì)方格星蟲(chóng)的生長(zhǎng)，體成分、組織硒含量和相關(guān)酶活性的影響，以期進(jìn)一步完善方格星蟲(chóng)的人工配合飼料配方，從而促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康、高效發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料制作

以原料水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量以及能值的測(cè)定作為制訂和調(diào)整飼料配方的依據(jù)。首先以酪蛋白、明膠為蛋白質(zhì)源，魚(yú)油為脂肪源，糊精為糖源配制基礎(chǔ)飼料(表1)，然后以亞硒酸鈉為硒源，將飼料中的硒設(shè)計(jì)為6個(gè)濃度梯度，分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mg/kg(干物質(zhì)基礎(chǔ))。添加的亞硒酸鈉中實(shí)際硒的含量為45.66%，因此每千克飼料中亞硒酸鈉的實(shí)際添加量分別為0、0.45、0.90、1.30、1.75 和 2.20 mg，實(shí)測(cè)試驗(yàn)飼料中硒含量分別為 0.19、0.37、0.63、0.82、1.06 和1.29 mg/kg(干物質(zhì)基礎(chǔ))，亞硒酸鈉采用溶液方式添加進(jìn)飼料中以保證能充分與飼料混合。所有原料粉碎后過(guò)篩網(wǎng)，根據(jù)配方中各原料的添加量逐級(jí)加入并混合均勻，再與魚(yú)油和卵磷脂充分混勻，最后將飼料制成過(guò)150目篩的顆粒，分別裝入標(biāo)號(hào)為 Se1、Se2、Se3、Se4、Se5、Se6 的樣品袋中備用。本飼料制作加工過(guò)程參照Blair等［18］介紹的方法。

1.2 養(yǎng)殖試驗(yàn)

本試驗(yàn)選用廣西海洋研究所海水增養(yǎng)殖基地繁育的同批方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)，自然狀態(tài)下體長(zhǎng)在1.5 ～1.8 cm 之間，平均體重為(16.12±0.26)mg。養(yǎng)殖試驗(yàn)階段，選用體重相近、健康無(wú)病的同一批方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)苗種7 200條，隨機(jī)選取400條為1個(gè)重復(fù)，3個(gè)重復(fù)為1組，共設(shè)6組，以重復(fù)為單位放入規(guī)格相同的18個(gè)水槽(65 cm×55 cm×45 cm)中養(yǎng)殖，水槽的底部均勻地鋪設(shè)3～4 cm厚的細(xì)沙，加水深約20 cm，養(yǎng)殖時(shí)間為2013年8—10月份，養(yǎng)殖周期為8周。6組稚星蟲(chóng)分別按順序投喂6種硒含量不同的人工微顆粒飼料。投喂方法為過(guò)量投喂，即保證沙子表面有少量未食用完全的飼料。養(yǎng)殖過(guò)程中的養(yǎng)殖條件為:自然光照周期，24 h連續(xù)微充氧，水溫維持在26～30℃，鹽度維持在 18～22，溶解氧濃度大于5.0 mg/L。

1.3 生長(zhǎng)、體成分和酶活性測(cè)定

飼養(yǎng)階段結(jié)束后，記錄稚星蟲(chóng)的成活條數(shù)，將稚星蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至海水深為10 cm左右的無(wú)沙水槽中停食吐沙2 d，之后收集各水槽內(nèi)的稚星蟲(chóng)并稱(chēng)重，稱(chēng)重后于液氮中快速冷凍，轉(zhuǎn)移至－80℃超低溫冰箱中保存。生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算公式如下:

成活率(survival rate，SR，%)=100×Nt/N0;

增重率(weight gain rate，WGR，%)=100×(Wt－W0)/W0;

特定生長(zhǎng)率(specific gain rate，SGR，%/d)=100 ×(ln Wt－ln W0)/t。

式中:N0為初始稚星蟲(chóng)條數(shù);Nt為終末稚星蟲(chóng)條數(shù);W0為初始稚星蟲(chóng)體重;Wt為終末稚星蟲(chóng)體重;t為試驗(yàn)天數(shù)。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

采用AOAC(1995)的方法分析試驗(yàn)稚星蟲(chóng)的體成分和飼料常規(guī)成分。分別采用105℃烘干至恒重法測(cè)定水分含量，凱氏定氮法(Kjeltec 8400，Sweden)測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量，索氏抽提法(Soxtec 2050，Switzerland)測(cè)定粗脂肪含量，550℃馬福爐中灼燒12 h法測(cè)定粗灰分含量。

稚星蟲(chóng)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)活性均采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測(cè)定。酶活性采用比活力(U/mg prot)表示。

采用GB 13885—2003方法進(jìn)行體壁(解剖剪剪開(kāi)后去除內(nèi)臟和體腔液所得)和蟲(chóng)體硒含量的測(cè)定。具體方法為:將樣品在550℃馬福爐中灰化，用濃鹽酸溶解殘?jiān)⑾♂尪ㄈ?，然后?dǎo)入原子吸收分光光度計(jì)的空氣－乙炔火焰中，測(cè)定硒的吸光度，并與硒校正溶液的吸光度比較定量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，若差異達(dá)到顯著，則進(jìn)行Tukey’s多重比較，顯著性水平為 P＜0.05。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響

從表2可知，飼料中硒含量從0.19 mg/kg上升至1.06 mg/kg時(shí)，各組方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的增重率、特定生長(zhǎng)率以及成活率并無(wú)顯著變化(P＞0.05)。而當(dāng)飼料中硒含量高達(dá)1.29 mg/kg時(shí)，方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的增重率與飼料中硒含量為0.19、0.37、0.63 和 1.06 mg/kg 時(shí)有顯著差異(P＜0.05)，特定生長(zhǎng)率和成活率與飼料中硒含量為0.19、0.37、0.63 mg/kg時(shí)有顯著差異(P＜0.05)。增重率和特定生長(zhǎng)率隨著飼料中硒含量的增加而增加，成活率是先升高后降低。

表2 飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of dietary selenium content on growth of juvenile peanut worm

2.2 飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體成分的影響

從表3可知，飼料中硒含量的變化對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的水分、粗蛋白質(zhì)和粗灰分的含量均沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)，僅對(duì)粗脂肪含量有極顯著的影響(P＜0.01)。隨著飼料中硒含量的增加，粗脂肪含量呈增加的趨勢(shì)，當(dāng)飼料中硒含量為1.29 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值3.77%。

2.3 飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體壁和蟲(chóng)體硒含量的影響

從表4可知，飼料中硒含量的變化對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體壁和蟲(chóng)體硒含量均有顯著影響(P＜0.05)，但當(dāng)飼料中硒含量超過(guò)0.19 mg/kg時(shí)，各組體壁和蟲(chóng)體硒含量都無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

2.4 飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng) GSH-Px和GR活性的影響

從表5可知，飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的GSH-Px和GR活性都有顯著影響(P＜0.05)。隨著飼料中硒含量的增加，方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的GSH-Px活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)飼料中硒含量達(dá)到1.29 mg/kg時(shí)，GSH-Px的活性達(dá)到29.98 U/mg prot。當(dāng)飼料中硒含量為0.19 mg/kg時(shí)，方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的GR活性為22.66 U/mg prot，顯著高于飼料中硒含量為 0.82、1.06 和1.29 mg/kg時(shí)(P＜0.05)。

表3 飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體成分的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 3 Effects of dietary selenium content on body composition of juvenile peanut worm(DM basis) %

表4 飼料硒水平對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體壁和蟲(chóng)體硒含量的影響Table 4 Effects of dietary selenium content on the content of selenium in body wall and body of juvenile peanut worm μg/g

表5 飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)GSH-Px和GR活性的影響Table 5 Effects of dietary selenium content on the activities of GSH-Px and GR of juvenile peanut worm U/mg prot

3 討論

3.1 飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響

硒對(duì)動(dòng)物具有營(yíng)養(yǎng)作用，但這種營(yíng)養(yǎng)作用只在飼料硒含量處于某個(gè)適宜范圍內(nèi)才有效，達(dá)不到或者超過(guò)這個(gè)范圍會(huì)引起硒缺乏癥或慢、急性中毒，這種關(guān)系是硒的Weinberg原理，即硒的劑量－效應(yīng)關(guān)系曲線［19］。本試驗(yàn)通過(guò)給方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)投喂8周不同硒含量的飼料，結(jié)果表明，方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的生長(zhǎng)明顯受到飼料中硒含量的影響，隨著飼料中硒含量的增加，方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的增重率和特定生長(zhǎng)率升高。這個(gè)試驗(yàn)結(jié)果與蘇傳福等［20］研究硒對(duì)草魚(yú)(Ctenopharynodon idellus)生長(zhǎng)的影響，梁萌青等［21］對(duì)飼料中硒添加水平對(duì)鱸魚(yú)(Lateolabrax japonicus)生長(zhǎng)性能的研究所得結(jié)果類(lèi)似。在本試驗(yàn)設(shè)定的范圍內(nèi)，各硒含量(0.19～1.29 mg/kg)對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)都有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，說(shuō)明這個(gè)范圍在動(dòng)物對(duì)硒的營(yíng)養(yǎng)需要的適宜劑量范圍之內(nèi)。飼料中的硒能提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的原因可能為:1)硒通過(guò)提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力來(lái)提高生長(zhǎng)性能，它能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖與分化，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，同時(shí)還能促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子［22］。2)硒通過(guò)提高GSH-Px的活性間接提高生長(zhǎng)性能。添加外源硒能提高GSH-Px活性，清除產(chǎn)生的自由基，并且GSH-Px的活性與缺硒病癥程度呈正相關(guān)，可通過(guò)測(cè)定GSH-Px的活性來(lái)判斷缺硒性疾病［23］。3)硒作為5'－脫碘酶的組成部分能介導(dǎo)甲狀腺激素的形成和降解，并催化四碘甲狀腺原氨酸(T4)轉(zhuǎn)變?yōu)槿饧谞钕僭彼?T3)，而生長(zhǎng)激素水平和胰島素水平都受T3的影響［1］。4)硒能提高消化酶如腸道淀粉酶、胰蛋白酶等酶的活性，增加消化吸收率，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)［24］。5)硒是動(dòng)物體內(nèi)有效的解毒劑，它能與有毒金屬離子結(jié)合成金屬硒蛋白復(fù)合物排出體外［25］。6)硒還能改善水產(chǎn)動(dòng)物在擁擠等惡劣環(huán)境中的氧化應(yīng)激反應(yīng)［26］。由于目前對(duì)于方格星蟲(chóng)的生理機(jī)能研究比較少，對(duì)方格星蟲(chóng)的認(rèn)識(shí)還比較有限，因此本試驗(yàn)在設(shè)置飼料硒濃度梯度時(shí)不夠理想，無(wú)法確定方格星蟲(chóng)對(duì)硒的適宜劑量范圍，不能確定當(dāng)硒含量達(dá)到1.29 mg/kg時(shí)硒對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)作用是否達(dá)到最大，但可以肯定在飼料中添加一定量的硒可以促進(jìn)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的生長(zhǎng)。

已有研究顯示，虹鱒(Salmo gairdneri)的硒需求量為 0.15 ～0.38 mg/kg(干物質(zhì)基礎(chǔ))［27］，鯰魚(yú)(Parasilirus asotus)為 0.25 mg/kg(干物質(zhì)基礎(chǔ))［28］，這2種魚(yú)需求量很相近，而方格星蟲(chóng)的硒需求量明顯比這2種魚(yú)要大，原因可能是方格星蟲(chóng)與這2種魚(yú)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.2 飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體成分的影響

目前，關(guān)于硒對(duì)動(dòng)物體成分影響的研究比較少。通過(guò)本試驗(yàn)可知，硒對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體成分的影響主要體現(xiàn)在對(duì)粗脂肪含量的影響上，對(duì)水分、粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量的影響都不顯著。由于硒是GSHPx的必需成分，GSH-Px能夠減少動(dòng)物體內(nèi)過(guò)氧化氫、脂肪酰氫過(guò)氧化物和脂肪酰乙醇的含量，從而減少脂肪的氧化［29］。在本試驗(yàn)中，飼料中硒含量由0.19 mg/kg增加到1.29 mg/kg時(shí)，方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體內(nèi)粗脂肪含量也由2.39%增加到3.77%。由此判斷，隨著硒含量的增加，方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體內(nèi)脂肪的氧化速度減小，可能會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)脂肪的積累量增多。此外，隨著飼料中硒含量的增加，各組增重率持續(xù)增加，這也可能是方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體內(nèi)粗脂肪含量持續(xù)增加的原因之一。

3.3 飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)的體壁和蟲(chóng)體硒含量及相關(guān)酶活性的影響

隨著飼料硒含量的增加，方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)體壁和蟲(chóng)體的硒含量也隨之增多，這可能與微量元素硒參與動(dòng)物體內(nèi)代謝機(jī)理有關(guān)。從本次試驗(yàn)可知，增加飼料中硒含量可以提高方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)蟲(chóng)體中硒的含量，而且烹飪對(duì)食物中的硒含量也不會(huì)損失，因此飼料中添加硒養(yǎng)殖出來(lái)的方格星蟲(chóng)可以作為一種重要的補(bǔ)硒水產(chǎn)品。有研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物體內(nèi)約有30個(gè)以硒為活性位點(diǎn)的物質(zhì)，這些含硒物質(zhì)能增強(qiáng)GSHPx的活性，并與維生素E協(xié)同作用來(lái)促進(jìn)機(jī)體的免疫能力和繁殖能力［30－31］。關(guān)于本試驗(yàn)中飼料中硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚蟲(chóng)GSH-Px和GR活性的影響在前人的研究中也得到相似的結(jié)果，比如Poston等［29］在1976年首次報(bào)道采食硒不足的大西洋鮭(Salmo salar)，其死亡率相對(duì)較高，血漿中GSH-Px活性降低，肌肉萎縮，品質(zhì)下降。Zhu等［32］用不同硒含量的飼料飼喂大口黑鱸(Micropterus salmoides)，一定范圍內(nèi)隨著硒含量的增加，鱸魚(yú)肝臟GSH-Px活性顯著升高，而肝臟GR活性顯著下降。

4 結(jié)論

改變飼料中的硒含量對(duì)方格星蟲(chóng)稚中的增重率、特定生長(zhǎng)率、成活率、粗脂肪含量、體壁硒含量、蟲(chóng)體硒含量、GSH-Px和GR活性有顯著影響。在飼料中適量添加硒可以促進(jìn)方格星蟲(chóng)的生長(zhǎng)，從而增加方格星蟲(chóng)的養(yǎng)殖產(chǎn)量。

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