奶牛乳腺血流量主要測定技術(shù)及其應(yīng)用

張 鑫 丁洛陽 王夢芝* 周 剛 張 軍，2

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009;2.揚州市揚大康源乳業(yè)有限公司，揚州 225004)

牛奶能夠提供人體所需的多種氨基酸，是目前人類主要的蛋白質(zhì)營養(yǎng)源之一［1］，其產(chǎn)量、品質(zhì)以及質(zhì)量安全的研究已經(jīng)成為營養(yǎng)學(xué)家們關(guān)注的熱點［2－4］。乳汁通過奶牛的乳腺合成分泌，而合成乳汁營養(yǎng)的前體物質(zhì)是由進入乳腺的血液提供的［5－6］。因此，在研究產(chǎn)奶牛泌乳過程時，乳腺血流量的測定是必不可少的環(huán)節(jié)。產(chǎn)奶牛乳腺血流量的測定是原料乳合成速率、乳腺對原料乳前體物吸收速率等相關(guān)研究的前提與基礎(chǔ)。目前，反芻動物乳腺血流量測定方法和技術(shù)雖然有電磁血流量計法、菲克原理、染料稀釋法和熱稀釋法等多種，但迄今為止，并沒有相對統(tǒng)一的測定技術(shù)，而且已知的研究多是以奶山羊為研究對象進行試驗，比如宋移福等通過Transit-time超聲血流計對奶山羊不同條件下乳腺血流量的測定及其準確性進行了評估。這在一定程度上影響了其研究結(jié)果的可比性和參考價值。為此，本文擬針對奶牛乳腺泌乳相關(guān)血管構(gòu)造和血流量的測量方法作以綜述，旨在為此研究方向的后續(xù)相關(guān)試驗研究提供一些參考。

1 奶牛乳腺血流量與泌乳的關(guān)系

血流量即血流的容積速度，是指單位時間內(nèi)流經(jīng)血管某一截面的血量，常以每分鐘毫升數(shù)或升數(shù)表示。血流量的大小與血管兩端的壓力差成正比，與血管對血流的阻力成反比。血流量的測定一般分為速度流量和體積(或容積)流量2種，速度流量比較直觀地表現(xiàn)血液的移動速度，體積流量則表示某段時間內(nèi)流過血液的體積。心血管系統(tǒng)為密閉的管道系統(tǒng)，流經(jīng)動脈、毛細血管和靜脈各段的總截面積的血流量相等，均等于心輸出量，但在并聯(lián)血管的各分路，即各器官的血流量是不同的。

奶牛乳腺內(nèi)的動脈由乳腺兩側(cè)的陰外動脈通入，陰外動脈位于髖關(guān)節(jié)和股關(guān)節(jié)之間的三角低洼處的中間，也就是臀中肌、股四頭肌和骨闊肌膜張肌的交叉點處［7］。2條陰外動脈經(jīng)由腹股溝管向下從腹腔進入乳腺區(qū)域，并分為前側(cè)乳腺動脈和近尾乳動脈。前側(cè)乳腺動脈通入前四分之一乳區(qū)，尾乳動脈通入后四分之一乳區(qū)。而乳房單側(cè)的靜脈血管又分為陰外靜脈和腹部皮下靜脈即所謂的乳靜脈，其位置與乳區(qū)的動脈大致平行，而后分別延伸至后腔靜脈和前腔靜脈并通入右心房(圖 1)［8］。

供給乳腺的動脈血液大部分是經(jīng)由乳房兩側(cè)的陰外動脈流入的，2條陰外動脈分別通入左右2個乳區(qū)，對于反芻動物尤其是泌乳期奶牛和奶山羊，乳汁中的營養(yǎng)物質(zhì)主要是由陰外動脈中的血液供給的(圖2)。然而，乳腺內(nèi)的靜脈血流出主要有3個方向:第1個是沿陰外靜脈穿過腹股溝而上行，第2個是沿皮下腹壁靜脈(乳靜脈)而出，此外還有個方向是經(jīng)會陰靜脈，由乳房后部通入會陰部，此靜脈明顯小于另外2條靜脈［9］。由于乳腺內(nèi)的靜脈有瓣膜(起閥門作用)的引導(dǎo)，陰外靜脈是幼齡反芻動物乳腺血流唯一流出渠道，而隨著動物年齡增長，瓣膜的閥門功能逐漸喪失，所以當牛羊站立時，靜脈血只能向下沿乳靜脈流出，其中甚至混有從陰外靜脈回流的非乳腺血液。與此相似，在動物俯臥時，乳靜脈閉合，血液經(jīng)陰外靜脈而出，其中同樣可能混有非乳腺血液［10］。因此，在測定反芻動物乳腺血流量時，通常采集動物站立時陰外動脈和乳靜脈的各種血液指標作為依據(jù)，獲得直接或間接的結(jié)果。進行乳靜脈采血時，為防止非乳腺血液從陰外靜脈回流，可用手夾緊陰外靜脈，但此法難以對牛操作，于是Kronfeld［11］發(fā)明以充氣氣球來阻塞陰外靜脈的方法。

圖1 奶牛乳腺血液循環(huán)系統(tǒng)Fig.1 Blood circulation system of the mammary gland in dairy cows

圖2 奶牛乳腺動脈分布圖Fig.2 Arterial supply to the mammary gland of the cow［12］

2 常用的乳腺血流量測定方法

2.1 電磁血流量計

電磁血流量計是根據(jù)法拉第電磁感應(yīng)定律制造的血管內(nèi)導(dǎo)電介質(zhì)(血液)體積流量的感應(yīng)式儀表。原理即是電磁感應(yīng)定律，將血管暴露與磁場下，血液作為導(dǎo)體，切割磁感線引起磁通量的變化從而產(chǎn)生電動勢(電壓)。在磁場強度，血管直徑，血液濃度不變時，此電動勢與血流速度成正比。

電磁血流量計的探頭分為2種:管型探頭和鉤形探頭。其中，管型探頭在使用時需切開血管以連接探頭，而鉤形探頭可直接勾住血管，避免了血管的切割性創(chuàng)傷，但所選擇探頭的直徑必須與所測血管直徑相適，且接觸緊密，要留出10%的間隙和氣泡［13］。

Dhondt等［14］曾用電磁法對奶牛陰外動脈進行急性試驗來研究乳腺血流量。而流量的校正又使電磁流量計用于長期性試驗成為可能，探頭每次使用前以量筒收集法進行校正，經(jīng)校正后的誤差可縮小至6%［15］，而多次重復(fù)校正可使誤差僅為 2%［16］。Petters等［13］成功地用電磁流量計進行長期血流量測定試驗，以此來研究產(chǎn)奶牛乳房內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的平衡。

使用電磁血流量計能夠直接讀取數(shù)據(jù)，可實時測得血液的瞬時流量，適用于血液流動變化的瞬間計時，這是它的優(yōu)點。其不足之處主要表現(xiàn)在使用前對探頭需要先進行校對，施加的磁場要均勻，使用過程中要保證探頭與血管的垂直，更要避免血管的扭曲、牽拉和變形。比如探頭插在陰外動脈，動脈的收縮亦可產(chǎn)生誤差影響試驗結(jié)果。

2.2 多普勒超聲血流計

多普勒超聲血流計是通過多普勒效應(yīng)測量血液的流速的。利用壓電晶體的壓電效應(yīng)產(chǎn)生超聲波，超聲發(fā)射裝置為聲源，血管中的紅細胞為接收者，利用多普勒效應(yīng)，流動中的紅細胞接收到超聲波時頻率將發(fā)生變化，而將超聲波反射后，利用壓電晶體的逆壓電效應(yīng)，超聲接收裝置會接收反射回的信號，基于多普勒效應(yīng)從而再測得回波的頻率。一般將發(fā)射的超聲波頻率和接收到的回波頻率之頻率差稱為頻率偏移或頻移［17］。而超聲波的速率遠大于血管中血細胞的流速，其頻移與血流速率亦成正比。即:

其中，△f為頻移值，f0為超聲波的發(fā)射頻率，v為血細胞的移動速度，c為聲波在介質(zhì)中的速度，α 為發(fā)射角［18］。

超聲波的發(fā)射亦可以分為連續(xù)多普勒(連續(xù)波)和脈沖多普勒(脈沖波)2大類，常用連續(xù)和脈沖2種多普勒系統(tǒng)來互補性能。Dauzat等［19］通過比較脈沖多普勒和電磁血流量計2種方法測定門靜脈血流量，結(jié)果表明，在用多普勒技術(shù)獲取數(shù)據(jù)時需十分謹慎，且由于儀器精密，對操作技術(shù)要求甚高，其結(jié)果極易受偶然因素影響，故此方法在使用上受操作誤差大和高成本的限制。

2.3 Transit-time超聲血流量計

Transit-time超聲血流量計又稱超聲瞬時血流計，其原理是應(yīng)用超聲波壓電晶體能夠監(jiān)測血流及血流的傳播信號之時間差。Transit-time超聲血流量計的探頭由1個探體和1個反射鏡組成，探體上有2個超聲傳感器呈一定角度固定于血管的一側(cè)，而反射器則位于另一側(cè)。

圖3 探頭安置血管示意圖Fig.3 Blood flow probe placed in a vessel［20］

上游的傳感器發(fā)出的超聲通過血管另一側(cè)的反射鏡反射并由下游的傳感器接收之后再由下游的傳感器發(fā)射超聲由上游傳感器接收，如此重復(fù)，2個傳感器交替輪作。當超聲波自上游發(fā)射下游接收時，聲波與血流同向而行，自發(fā)射至接收的時間會因順流而縮短，反之，逆血流的超聲波傳遞的時間會增長。根據(jù)接收到的2次超聲波時間，計算其時間差值就是體積(容量)流量的測量值即血流量。

優(yōu)點:血管均勻地位于寬面超聲束中，經(jīng)過血管的超聲波束進行積分，而之外的超聲束面則不在積分范圍之內(nèi)，所以此方法不受血管橫截面大小的影響。此外，由于發(fā)射2次超聲并測其時間差，所以即使探頭與血管未能相互垂直，測定結(jié)果亦不受影響。Transit-time超聲血流量計具有對血管尺寸的不依賴性和探頭角度的不敏感性的優(yōu)點，使其可用于正在生長的血管、收縮的血管和靜脈束;其缺點是此法仍帶有一定的創(chuàng)傷性，另外，早期的Transit-time超聲血流量計在測量低流量時誤差較大。Forsberg 等［21］和 Westra 等［22］分別有研究表明，在測量低流量(＜150 mL/min)時誤差可達21%～25%，然而此誤差在后來的儀器改進中已被逐漸減小。

Transit-time超聲血流量計目前已得到了學(xué)者的普遍使用。例如，Rigout等［23］研究了以草料和青貯料為基礎(chǔ)飼糧的奶牛十二指腸灌注葡萄糖對整個機體和乳腺利用血糖的影響，以超聲血流量計檢測乳腺血流量發(fā)現(xiàn)灌注后比正常值提升了45%。隨后Rulquin等［24］在研究灌注葡萄糖對奶牛乳腺中氨基酸循環(huán)的影響時，也使用同樣的方法對乳腺血流量進行測定。Delamaire等［25］對擠奶間隔的延長降低乳腺血流量與乳腺對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取的研究中更直觀地顯示了對乳腺血流量的需要，通過超聲血流量計檢測，表明擠乳間隔時間越長，與將會導(dǎo)致乳腺營養(yǎng)吸收下降的關(guān)系越密切，而不是與乳腺將這些養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為牛奶成份的效率降低有關(guān)。乳腺對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的降低，是由于乳腺血流量減少而產(chǎn)生的。

2.4 菲克原理法

菲克原理可描述為在單位時間內(nèi)通過垂直于擴散方向的單位截面積的擴散物質(zhì)流量與該截面積處濃度梯度成正比。將此原理應(yīng)用于乳腺血流量的測定時，以血液中某物質(zhì)的動靜脈濃度差作為開始擴散的前體物質(zhì)濃度，該物質(zhì)在乳汁中的濃度則被視為沿擴散方向擴散后的濃度。故以乳汁中某物質(zhì)的濃度除以血液中該物質(zhì)的動靜脈濃度差的方法常用來估測乳腺血流量，因此，此法需要分別采集陰外動脈血和乳腺靜脈血為樣本。

Mepham［26］以苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)為內(nèi)標分別測出2種氨基酸在動靜脈血和乳汁中的濃度并以此估算乳腺血流量。Cant等［27］將此方法進行了修正后得出以下公式:

乳腺血流量(L/d)=0.965×FYB/FYA－V。

其中，F(xiàn)YB(mol/d)=乳中(Phe+Tyr)濃度(mol/L)×產(chǎn)奶量(L/d);FYA－V(mol/d)= 動脈血中(Phe+Tyr)濃度(mol/L)－靜脈血中(Phe+Tyr)濃度(mol/L)。

這種方法一般被稱為氨基酸動靜脈濃度差法。

除此之外，以一定量的指示劑注入血管中再測其稀釋后的濃度從而測得血流量均是以菲克原理為基礎(chǔ)的方法。常用的有染料稀釋法、乳房甲硫氨酸吸收法和同位素擴散法等。染料稀釋法近年來普遍選用對氨基馬尿酸(PAH)作為指示劑。一般是將PAH注入動脈(或靜脈)后，以恒定的速度連續(xù)靜脈(或動脈)采血，再用分光光度計測出染料濃度，繪制濃度稀釋曲線。Katz等［28］研究發(fā)現(xiàn)，PAH完全不被肝清除，而在循環(huán)至腎時由腎清除，部分PAH由動脈再循環(huán)至肝，因此在測量奶牛乳腺血流量時，有3種灌注PAH和采血的方法:頸靜脈灌注，頸動脈和乳靜脈采血;乳靜脈灌注，乳靜脈下游和頸動脈采血;陰外動脈灌注，陰外動脈下游和乳靜脈采血。孫滿吉對此3種方法進行比較試驗，研究發(fā)現(xiàn)使用頸靜脈灌注PAH測得的血流量偏低，而由陰外動脈灌注，陰外動脈下游和乳靜脈采血的方法較為科學(xué)。

以菲克原理測定奶牛的乳腺血流量，避免了其他血流量計的成本問題以及使用時需要對奶牛進行手術(shù)植入儀器的限制，因此在操作非常方便，應(yīng)用廣泛，但其準確性卻并未得到公認的贊同［29］。Pacheco-Rios等［30］比較了氨基酸動靜脈濃度差法和同位素(氚化水)擴散法，發(fā)現(xiàn)以氚化水為指示劑估測出的血流量與產(chǎn)乳量的比值為395，而Phe+Tyr動靜脈濃度差估測得出的血流量與產(chǎn)乳量比值為602，屬正常范圍450～900之內(nèi)。因此氨基酸動靜脈濃度差法估測乳腺血流量較氚化水法更近似于真實值。

2.5 熱稀釋法

Fegler［31－32］熱稀釋法也叫溫差稀釋法或溫度稀釋法，將低溫的溶液(生理鹽水或等滲葡萄糖)注入血液中，測定溫度的局部變化:將帶有熱敏電阻的導(dǎo)管插入乳腺靜脈下游，向?qū)Ч軆?nèi)注入低溫溶液后，熱敏電阻測量溶液入血后溫度的變化情況，即可記錄下溫度稀釋曲線。熱稀釋法注射的指示劑完全屬于生理溶液，無再循環(huán)，對生理機能幾乎沒有影響，不會有染料在體內(nèi)蓄積之顧慮，故而短時間可重復(fù)測定。但此方法仍具有創(chuàng)傷性，另外熱敏電阻對低溫的敏感性要求注入的溶液溫度越低電阻越敏感，但低溫又會受室溫的影響使得誤差較大。所以現(xiàn)在一般的建議是指示劑采用室溫的生理鹽水且同時加大用量。然而，由于清醒動物的中心靜脈壓可能受到外來因素影響的緣故，此法測得數(shù)據(jù)準確性不高，且過程冗長耗時，為此經(jīng)過改進的連續(xù)熱稀釋法已克服了這些缺點。

Linzell等［10］以連續(xù)熱稀釋法對奶山羊進行試驗，將乳靜脈環(huán)狀剝離出體內(nèi)，以便安置熱敏電阻和阻斷血管與組織的熱交換，用室溫下生理鹽水在20～60 s內(nèi)勻速連續(xù)地注入乳靜脈，同時血液的溫度變化被熱敏電阻測得并連續(xù)地記錄在紙上。如此，即時測量血液溫度的降低可使血流量計算更迅速，而連續(xù)的記錄則更加便于估測平均血流量。試驗所得數(shù)據(jù)分別與單獨注射熱稀釋、菲克原理估測法和量筒收集法的結(jié)果進行比較，證明了其精確性與上述3種方法均一致。

值得注意的是，由于前面提到的關(guān)于乳腺內(nèi)靜脈血的流向問題——反芻動物從出生到首次泌乳，血液只由陰外靜脈流出而不通過乳靜脈，故熱稀釋法在此無法使用。但針對母畜生育后的非哺乳期，以連續(xù)熱稀釋法測定此時較低的乳腺血流量卻具有較高的準確性。

2.6 其他方法

除上述方法之外，還有放射性微球法、核磁共振法、彩色多普勒流量測定法和彩色血流流速流量測定法等可用于測量血流量。

用放射性微球來測量血流量優(yōu)點是快速且結(jié)果誤差小，但其明顯缺陷就是具有創(chuàng)傷性，若測器官血流量則需要處死并解剖動物，只能一次性試驗，無法對動物進行后續(xù)的研究。因此，放射性微球法對于奶牛乳腺泌乳量以及營養(yǎng)調(diào)控等研究缺乏實際意義。

核磁共振法的原理是血液流過正負梯度變化的磁場時產(chǎn)生累加的相位位移，此位移與血液流動的速度成正比，相位位移在圖像上顯示為像素信號強度的變化而被記錄下來［33］;彩色多普勒法需使用安裝有VP軟件的彩色多普勒超聲診斷儀［34］，而彩色血流流速流量測定法則需依靠安裝有CVIQ軟件的彩色超聲儀和線陣探頭［35］，這3種儀器測量血流量的準確性較高，且都屬于無創(chuàng)性方法;但都由于設(shè)備成本的原因，加上操作過程要求復(fù)雜、精細，存在諸多局限性，目前較多是在臨床醫(yī)學(xué)診斷上使用而非用于動物生產(chǎn)性試驗，所以在此亦不多作贅述。

3 小結(jié)

隨著國內(nèi)外先進技術(shù)的發(fā)展和測量儀器設(shè)備的不斷升級，早期曾一度較多使用的一些測血流量的方法比如量筒收集法和氣泡血流計等已不再適用于目前的科學(xué)研究之中;現(xiàn)在電磁血流量計和多普勒超聲波血流量計現(xiàn)應(yīng)用比較廣，使用這2種儀器可測得奶牛乳腺血流的速度流量，即通過讀數(shù)能直接觀測到血流速度的瞬時變化;而Transit-time超聲血流量計則是測定血液的體積流量，由于其容易校準且是目前最為精確的血流量測定設(shè)備，被公認為當今血流量計的“黃金標準”。但是一些地區(qū)由于經(jīng)濟條件的影響，以上各種設(shè)備的使用和普及受到很大程度的限制，所以基于菲克原理的各種方法在奶牛乳腺血流量的研究中使用仍較為普遍。然而菲克原理法又因為具體操作方法多種多樣，人工操作隨機性大，且受奶牛的生理習性和應(yīng)激的影響，具有一定的局限性。因此，奶牛乳腺血流量測定時可根據(jù)具體的研究方向、研究目的、試驗設(shè)計來選取合適的測定方法。

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