高產(chǎn)丁醇菌株誘變選育及發(fā)酵研究

王義強(qiáng) 王啟業(yè) ，華連灘 ，彭牡丹 ，鐘 潔 ，羅 浪

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3. 國(guó)家林業(yè)局生物乙醇研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

高產(chǎn)丁醇菌株誘變選育及發(fā)酵研究

王義強(qiáng)1,2,3，王啟業(yè)2，華連灘2，彭牡丹2，鐘 潔2，羅 浪2

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3. 國(guó)家林業(yè)局生物乙醇研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

菌株是丁醇發(fā)酵生產(chǎn)的重要因素，優(yōu)良丁醇菌株的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化是提高丁醇產(chǎn)量的有效途徑。本研究選取工業(yè)上重要的產(chǎn)丁醇菌株——拜氏梭菌Clostridium beijerinckiiATCC 55025為對(duì)象，進(jìn)行紫外誘變，獲得了一株丁醇產(chǎn)量高、耐受性強(qiáng)和穩(wěn)定性好的優(yōu)良突變株Clostridium beijerinckiiU-57，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保存，注冊(cè)號(hào)為CCTCC M 2013208。該突變株發(fā)酵產(chǎn)丁醇和總?cè)軇ū?、丁醇、乙醇）分別為6.44 g/L、10.57 g/L，較原始菌株分別提高了7.15%、6.98%。采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)以及Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，對(duì)突變株U-57的最佳培養(yǎng)基組分進(jìn)行了篩選。進(jìn)一步通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)突變株U-57的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)酵得丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為7.85 g/L、12.28 g/L，比優(yōu)化前分別提高了21.9%、15.3%。研究結(jié)果為進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

拜氏梭菌；誘變；響應(yīng)面法；丁醇發(fā)酵

在化石能源大量消耗和環(huán)境污染日益嚴(yán)重的今天，找尋環(huán)境友好型，經(jīng)濟(jì)可行性，能夠替代化石能源的可持續(xù)發(fā)展能源是全球共同關(guān)心的熱點(diǎn)問題[1-2]。丁醇不僅是重要有機(jī)溶劑和化工原料，也是可再生能源。作為生物燃料，丁醇具有能量密度大，燃燒值高，蒸汽壓較低；與汽油能以任意比例混合；揮發(fā)性低，可管道輸送；腐蝕性較小、水溶性低、污染輕等優(yōu)點(diǎn)[4]。因此,丁醇燃料現(xiàn)已成為新一代可再生能源研究開發(fā)的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。

目前，丁醇的生產(chǎn)方法分為化學(xué)法和生物法，化學(xué)法主要包括乙醛醇醛縮合法和丙烯羰基合成法，生物法為微生物發(fā)酵法[3]。20世紀(jì)中葉起，隨著石油化工業(yè)的迅速發(fā)展，當(dāng)時(shí)的發(fā)酵法已被以丙烯為原料的羰基合成法取代，因此發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇的發(fā)展受到阻礙。近年來(lái)，由于石油資源大量開采和利用而變得日益緊缺，導(dǎo)致其價(jià)格也快速上漲，從而導(dǎo)致化學(xué)法生產(chǎn)丁醇成本的不斷增加。發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇技術(shù)重新顯示出其優(yōu)越性，發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇實(shí)現(xiàn)了以可再生資源替代不可再生的石油資源原料，與國(guó)家能源的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略相符合[5-8]。

利用可再生原料通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇受到人們的普遍關(guān)注。工業(yè)上常用的產(chǎn)丁醇菌有Clostridium beijerinckiiBA101、Clostridium beijerinckiiATCC 55025、Clostridium acetobutylicum824、Clostridium acetobutylicumNCIB 8052、Clostridium saccharobutylicumATCC BAA-117等，選育高產(chǎn)丁醇菌株是提高生產(chǎn)效益的重要途徑之一。在自然環(huán)境中，菌種的突變頻率低、幅度小，而通過人工誘發(fā)的突變是最常見的微生物菌種選育方法[7,9-10]。高產(chǎn)菌株的選育主要包括誘變選育和構(gòu)建基因工程菌。前者通過非定向誘變，再進(jìn)行選擇性篩選，從大量的突變體中篩選出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變株；后者通過定向改變丁醇代謝途徑中決定丁醇產(chǎn)量高低的某一個(gè)或者多個(gè)基因，來(lái)提高菌種目標(biāo)代謝產(chǎn)物。

本研究選用工業(yè)上重要的產(chǎn)丁醇菌株——拜氏梭菌Clostridium beijerinckiiATCC 55025為出發(fā)株，采用紫外誘變方法篩選得到了1株遺傳穩(wěn)定性好的高產(chǎn)突變株，并對(duì)高產(chǎn)突變株發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，為進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

拜氏梭菌Clostridium beijerinckiiATCC 55025，來(lái)源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American type culture collection)，為工業(yè)上重要的產(chǎn)丁醇菌株。

1.1.2 主要儀器

電鼓風(fēng)干燥箱101-1AB：天津泰斯特；純水機(jī)：艾科浦；pH計(jì)：德國(guó)賽多利斯；高壓滅菌鍋HVE-50：日本Hirayama；超凈工作臺(tái)W-CJID：天津泰斯特；生化培養(yǎng)箱：寧波萊福科技；722型分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器；恒溫振蕩器：深圳市寶域科技；厭氧培養(yǎng)盒：日本三菱；氣相色譜儀GC-14C：日本島津；離心機(jī)KITMAN-T24：日本TOMY。

1.1.3 主要試劑

胰蛋白胨、牛肉膏（Oxoid公司）；酵母浸粉（Aobox公司）；瓊脂（Biosharp公司）；葡萄糖、氯化鈉、可溶性淀粉、L-半胱氨酸鹽酸鹽、乙酸鈉、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、 醋酸銨、水解干酪素、MnSO4、天冬酰胺、溴甲酚紫、CaCO3、氨基苯甲酸、硫胺等均為國(guó)產(chǎn)分析純（國(guó)藥集團(tuán)）

1.1.4 培養(yǎng)基

(1)普通培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0、酵母浸粉3.0 g、葡萄糖5.0 g、氯化鈉5.0 g、可溶性淀粉1.0 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、乙酸鈉3.0 g、蒸餾水1.0 L。充分溶解，調(diào)pH到6.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌，20 min。斜面培養(yǎng)加1.5%的瓊脂。

(2)YEM篩選培養(yǎng)基：葡萄糖40 g、酵母浸粉2 g、牛肉膏2 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.2 g、FeSO4·7H2O 0.01g、醋酸銨 3 g、瓊脂 15 g、蒸餾水1.0 L。充分溶解，調(diào)pH到6.8，115℃高壓蒸汽滅菌20 min。

(3)BCP篩選培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、酵母浸粉8 g、水解干酪素2.2 g、MnSO40.01 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、天冬酰胺4g、溴甲酚紫0.4g、瓊脂15 g、蒸餾水1.0 L。充分溶解，調(diào)pH到7.0，115℃高壓滅菌20 min。

(4)丁醇耐受性選擇培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基中分別加入0 g、5 g、10 g、15 g、20 g、25 g丁醇。

(5)種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g、酵母浸粉2 g、醋酸銨 3 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.1 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、MnSO40.01 g、L-半 胱 氨 酸 鹽 酸鹽0.5g，蒸餾水1 L。充分溶解，調(diào)PH到6.8，115℃高壓滅菌20 min。

(6)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g、酵母浸粉1 g、醋 酸 銨 3 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.2 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、MnSO40.01 g、CaCO32 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，蒸餾水1 L。充分溶解，調(diào)pH到6.8，115℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌培養(yǎng)方法

平板培養(yǎng)：涂布平板后，37℃厭氧培養(yǎng)2～3天。厭氧盒使用前噴灑75%酒精并紫外照射20 min。

種子培養(yǎng)：100 mL搖瓶，裝液量80%，37℃厭氧恒溫培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：100 mL搖瓶，裝液量80%，37℃厭氧恒溫培養(yǎng)72 h。

1.2.2 ATCC 55025菌懸液的制備及紫外誘變

取長(zhǎng)勢(shì)好的菌液，3000 r/min離心10 min，去上清液，加入無(wú)菌生理鹽水，搖勻洗滌，3 000 r/min離心10 min，去上清液，加入無(wú)菌生理鹽水，打撒菌體搖勻，再用無(wú)菌生理鹽水稀釋至108個(gè)/mL。

取上述單細(xì)胞懸液10 mL，于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，磁力攪拌下距20W紫外燈20 cm，處理 10 s、25 s、40 s、55 s、70 s，取每個(gè)照射時(shí)間的菌懸液0.1 mL，加無(wú)菌生理鹽水稀釋到1 mL，適當(dāng)稀釋后取0.1 mL涂布平板，37℃厭氧培養(yǎng)2～3 d，記錄菌落數(shù)，計(jì)算致死率，繪制時(shí)間-致死率曲線。

1.2.3 高產(chǎn)突變菌株的篩選

(1)平板篩選

取1 mL處理液經(jīng)梯度分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍后，涂布到Y(jié)EM平板，每個(gè)梯度3個(gè)平板，避光37℃厭氧培養(yǎng)2 d。用無(wú)菌牙簽挑取YEM平板上的菌落，轉(zhuǎn)接到BCP平板，避光37℃厭氧培養(yǎng)培養(yǎng)36 h，黃色透明圈為正常菌落，紫色為產(chǎn)酸較低的突變株。

(2)發(fā)酵篩選

將平板篩選得到的突變株接到接種到種子培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24 h后，以5%的接種量接種到裝有80%發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL搖瓶中，37℃厭氧恒溫培養(yǎng)72 h后，氣相色譜檢測(cè)發(fā)酵液中丁醇及總?cè)軇┑暮?，得到高產(chǎn)丁醇突變株。以同樣的方法進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.4 遺傳穩(wěn)定性

將篩選得到的高產(chǎn)丁醇菌接到種子培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)2 d作為F1代，后再連續(xù)繼代6次，得到 F2、F3、F4、F5、F6、F7代，并且在繼代的同時(shí)將各代菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)72 h，氣相色譜測(cè)發(fā)酵液中丙酮、丁醇和乙醇含量，根據(jù)測(cè)定結(jié)果判斷其穩(wěn)定性。

1.2.5 突變株與原始菌株丁醇耐受性比較

將出發(fā)菌ATCC 55025和高產(chǎn)丁醇突變株分別接到含有不同濃度梯度丁醇的耐受性選擇培養(yǎng)基平板[8]上，37℃厭氧培養(yǎng)2 d，觀察比較菌株間對(duì)丁醇的耐受性。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基主要組分的Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)

在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析軟件Minitab15進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)，根據(jù)軟件給出的實(shí)驗(yàn)矩陣表確定各實(shí)驗(yàn)組的編碼與取值[11-15]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)葡萄糖、酵母粉、醋酸銨、KH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、CaCO3、L- 半 胱氨酸鹽酸鹽8個(gè)因素進(jìn)行全面考察，選用N=12的PB設(shè)計(jì)，并根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定低水平(-1)值，高水平(1)為低水平的1.25倍，以丁醇產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值。通過實(shí)驗(yàn)，軟件分析數(shù)據(jù)，篩選出重要影響因素。

1.2.7 對(duì)丁醇發(fā)酵影響較大培養(yǎng)基組分響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

對(duì)上述Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)選出影響丁醇產(chǎn)量的重要因子，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并利用軟件做響應(yīng)面分析，從而獲得培養(yǎng)基中各重要因子的最佳組合[16-18]。

1.2.8 初始pH、接種量及裝液量對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察初始pH、接種量和裝液量三個(gè)條件因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響。選擇L9(34)正交表進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，每組3個(gè)重復(fù)。利用方差分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而確定發(fā)酵條件的最佳組合[19-21]。

1.2.9 發(fā)酵產(chǎn)物氣相色譜檢測(cè)

采用氣相色譜測(cè)定發(fā)酵液中溶劑的含量。氣相色譜條件為色譜柱：安捷倫HP-INNOWAX，30 m×0.25 mm；檢測(cè)器：FID；N2為載氣，流速為35 mL/min，H2流速為35 mL/min，空氣流速為350 mL/min；初始柱溫45℃，保留1 min，然后以5℃/min升至150℃，保留2 min；進(jìn)樣口溫度為180℃；檢測(cè)器溫度為200℃；進(jìn)樣量為1 μL，分流比為1：60，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變及突變株的篩選

2.1.1 誘變劑量的選擇

通過圖1可以得出，紫外照射時(shí)間增加，ATCC 55025菌體的致死率也隨之升高。在初期致死率升高較快，但是在100 s之后，隨著照射時(shí)間的增加ATCC 55025菌體致死率變化幅度卻在逐漸下降。100 s時(shí)，致死率已經(jīng)達(dá)到87.6%，145 s時(shí)，致死率達(dá)到98.3%。經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為致死率在80%～90%之間的處理較佳，所以選擇致死率為87.6%時(shí)的100 s作為處理時(shí)間。

2.1.2 高產(chǎn)丁醇突變株的選育

出發(fā)菌株紫外誘變后經(jīng)篩選培養(yǎng)基初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩后，獲得一株性能優(yōu)良的突變株，命名為Clostridium beijerinckiiU-57。在初始糖濃度為50 g/L的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，結(jié)果見表1，從表1可以看出，丁醇、丙酮、乙醇、總?cè)軇┊a(chǎn)量都比出發(fā)菌株高，說(shuō)明此突變菌株從葡萄糖到丁醇、丙酮和乙醇代謝通路都有增強(qiáng)。丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量較原始菌株分別提高了7.15%、6.98%。

圖1 ATCC 55025紫外照射致死率曲線Fig.1 Percentage dead after treatment of Clostridium beijerinckii ATCC 55025 with ultraviolet radiation

表1 在葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中出發(fā)菌株和突變菌株溶劑的產(chǎn)生情況Table 1 Solvents production by the original and mutant strains in fermentation medium with glucose

2.1.3 突變株U-57遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

突變株U-57遺傳穩(wěn)定性結(jié)果分別見表2。由表可知，突變株U-57經(jīng)6次傳代獲得的7代菌株(F1～F7)發(fā)酵特性沒有明顯變化，丙酮、乙醇、丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量基本趨于平穩(wěn)，說(shuō)明此突變菌株遺傳穩(wěn)定性好，適合進(jìn)一步研究及工業(yè)化應(yīng)用。

表2 突變株U-57遺傳穩(wěn)定性Table 2 Genetic stability of mutated strain U-57

2.1.4 突變株U-57與原始菌株丁醇耐受性比較

原始菌ATCC 55025與突變株U-57丁醇耐受性結(jié)果見表3。從表中可知，丁醇對(duì)菌體的毒性較大，丁醇濃度在30 g/L及以上時(shí)，原始菌株和突變株U-57都無(wú)法生長(zhǎng)。當(dāng)丁醇濃度在10～20 g/L時(shí)，突變株U-57生長(zhǎng)情況比原始菌好，說(shuō)明突變株U-57在一定丁醇濃度范圍內(nèi)對(duì)丁醇的耐受性強(qiáng)于原始菌株。

表3 丁醇對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響?Table 3 Effect of butanol on the growth of strain

2.2 突變株U-57發(fā)酵培養(yǎng)基與條件優(yōu)化

2.2.1 影響丁醇產(chǎn)量的主要培養(yǎng)基組分

利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析軟件Minitab15的Plackett-Burman模塊設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。進(jìn)一步對(duì)表4的結(jié)果用此軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。從表5中可得知，A、C和G三因素的P值都小于0.05，在大于95%的概率水平上差異顯著；其余5個(gè)因素B、D、E、F和H的P值都大于0.05，在大于95%的概率水平上差異不顯著。因此，葡萄糖(A)、醋酸銨(C)和CaCO3(G)是影響丁醇產(chǎn)量的主要因素。

圖2為各因子貢獻(xiàn)Pareto圖，它是側(cè)重于顯示引起問題的因素之間的相對(duì)大小，在顯著水平為0.05時(shí)，同樣可以得出對(duì)丁醇產(chǎn)量影響顯著的因素為葡萄糖、醋酸銨和CaCO3。

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Experimental design and results of the Plackett-Burman

2.2.2 產(chǎn)丁醇發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)[11-13]篩選出了葡萄糖(X1)、醋酸銨(X2)、CaCO3(X3)是影響丁醇產(chǎn)量的主要因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，對(duì)這三個(gè)因素，采用響應(yīng)面法進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。以Y（丁醇產(chǎn)量）為響應(yīng)值，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[13-15]設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

表5 各因素影響的主效應(yīng)分析?Table 5 Analysis of main effects of factors for Plackett-Burman design

圖2 8個(gè)因素的效應(yīng)Pareto圖分析Fig.2 Pareto chart of eight-factor standard effects on production of butanol

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Result of the response surface test

以丁醇產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，三因素質(zhì)量濃度為自變量，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得回歸方 程 為：Y=7.54+0.38X1-0.21X2-0.15X3-0.27X1X2+0.57X1X3-0.1X2X3-0.51X12-0.53X2

2-0.14X3

2。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果為表7，由此可知，葡萄糖、醋酸銨和碳酸鈣三個(gè)因素的質(zhì)量濃度對(duì)丁醇產(chǎn)量影響均達(dá)到顯著水平。對(duì)回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值和回歸系數(shù)檢驗(yàn)性進(jìn)行比較，判斷因子影響丁醇產(chǎn)量的大小順序?yàn)椋浩咸烟牵敬姿徜@＞CaCO3。二次回歸模型的R2為0.990 7，方程P值＜0.05，失擬檢驗(yàn)P值為0.124 7＞0.05，失擬不顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。因此模型選擇正確，可用于預(yù)測(cè)丁醇產(chǎn)量。

表7 方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 7 Variance analysis and significance test

進(jìn)一步利用軟件Design-Expert繪制模型Y的響應(yīng)面立體曲面圖和等高線圖（圖3、4、5）。從響應(yīng)面分析圖可知響應(yīng)面變量Y有最大值，即X1、X2和X3存在極值點(diǎn)。利用Design-Expert軟件進(jìn)行分析后可知丁醇產(chǎn)量(Y)最大響應(yīng)值為7.64 g/L，各因素的最佳取值分別為：葡萄糖質(zhì)量濃度為53.66 g/L，醋酸銨質(zhì)量濃度為3.82 g/L，CaCO3質(zhì)量濃度為2.60 g/L。

根據(jù)模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)值，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基[15-17]進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)模型的適用性進(jìn)行驗(yàn)證。丁醇的平均產(chǎn)量為7.55 g/L，與模型理論值相差1.19%，可見該模型能夠預(yù)測(cè)丁醇產(chǎn)量的情況。

2.2.3 產(chǎn)丁醇發(fā)酵條件優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定發(fā)酵溫度37℃，對(duì)發(fā)酵初始pH(A)、接種量(B)、裝液量(C)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。通過L9(34)正交表設(shè)計(jì)的方案，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表8。對(duì)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表9。根據(jù)上述正交實(shí)驗(yàn)并結(jié)合圖表得出突變株U-57的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度37℃、初始pH 6.5、接種量6%、裝液量85%，此時(shí)的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為7.85、12.28 g/L。

圖3 葡萄糖與醋酸銨交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.3 Response surface and the contour of interaction of glucose and ammonium acetate

圖4 葡萄糖與CaCO3交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface and the contour of interaction of glucose and CaCO3

圖5 醋酸銨與CaCO3交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and the contour of interaction of CaCO3 and ammonium acetate

3 結(jié) 論

以Clostridium beijerinckiiATCC 55025為出發(fā)菌株，采用紫外誘變，獲得最適紫外照射時(shí)間為100 s，對(duì)經(jīng)過紫外線誘變之后的菌落進(jìn)行平板初篩，發(fā)酵復(fù)篩，最終得到丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量高的突變株U-57。經(jīng)過7代發(fā)酵試驗(yàn)，突變株U-57遺傳穩(wěn)定性好，丁醇耐受性較強(qiáng)，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)總?cè)軇?0.57 g/L，其中丁醇為6.44 g/L，較原始菌株分別提高了6.98%和7.15%。

表8 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of orthogonal experiment

表9 正交實(shí)驗(yàn)方差分析和顯著性檢驗(yàn)Table 9 Variance analysis and significant of orthogonal experiment

在對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中11個(gè)組分單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取了8個(gè)對(duì)丁醇產(chǎn)量影響較明顯的8個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)得到了影響丁醇產(chǎn)量的3個(gè)顯著性因素，即葡萄糖質(zhì)量濃度、醋酸銨質(zhì)量濃度和CaCO3質(zhì)量濃度。在Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響丁醇產(chǎn)量顯著的3個(gè)因子做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以丁醇產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，得到了預(yù)測(cè)丁醇產(chǎn)量的模型：

Y=7.54+0.38X1-0.21X2-0.15X3-0.27X1X2+0.57X1X3-0.1X2X3-0.51X12-0.53X22-0.14X3

2，其中X1為葡萄糖質(zhì)量濃度、X2為醋酸銨質(zhì)量濃度、X3為CaCO3質(zhì)量濃度。

通過軟件預(yù)測(cè)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到了發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成為：葡萄糖53.66 g/L、酵母浸粉1.5 g/L、醋酸銨3.82 g/L、KH2PO40.75 g/L、MgSO40.2 g/L、FeSO4·7H2O 20 mg/L、MnSO410 mg/L、CaCO32.60 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L、對(duì)氨基苯甲酸3 mg/L、硫胺2 mg/L。

在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵條件做單因素實(shí)驗(yàn)，然后根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)，得到最佳發(fā)酵條件為：溫度37℃、初始pH 6.5、接種量6%、裝液量85%。最終得到的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為7.85、12.28 g/L，其中丁醇產(chǎn)量提高了21.9%，總?cè)軇┊a(chǎn)量提高了15.3%。

本研究獲得了一株高產(chǎn)丁醇的優(yōu)良突變株Clostridium beijerinckiiU-57，保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（注冊(cè)號(hào)：CCTCC M 2013208），同時(shí)優(yōu)化了其發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件，為進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

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Study on breeding and fermentation conditions of a high-yielding butanol strain mutant

WANG Yi-qiang1,2,3, WANG Qi-ye2, HUA Lian-tan2, PENG Mu-dan2, ZHONG Jie2, LUO Lang2
(1. Key Lab ofNon-wood Forest Nurturing and Protection of National Ministry of Education, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Biotechnology Laboratory of Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004, Hunan, China; 3.Bio-ethanol ResearchCenter of State Forestry Administration, Changsha 410004, Hunan, China)

Strain is an important factor of butanol fermentation production, excellent butanol strains breeding and fermentation condition optimization is an effective way to increase butanol production.Clostridium beijerinckiiATCC 55025,an industry important butanol producing strain, was taken as the original strain ,treated with UV mutation. Finally we have got a mutant which has high butanol yield,strong butanol tolerance and good genetic stability, namedClostridium beijerinckiiU-57 which conserved in China Center for Type Culture Collection, registration number for CCTCC M 2013208.The yield of butanol and total solvent produced by mutant U-57 were 6.44 g/L and 10.57 g/L, which were 7.15% and 6.98% higher than the original strain. Through the Plackett-Burman design and Box-Behnken response surface design, the best medium components for the mutant strain U-57 fermentation was screened. Further through the orthogonal experiment, fermentation conditions of mutant U-57 were optimized. Under the best conditions, the yield of butanol and total solvent produced by mutant U-57 were 7.85 g/L and 12.88 g/L, which were 21.9% and 15.3% higher than before. The results provides a basis for further industrial application.

Clostridium beijerinckii; Mutation; Response surface methodology; Butanol fermentation

S718.8

A

1673-923X(2015)10-0120-07

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.021

2014-03-25

國(guó)家林業(yè)局“948”項(xiàng)目“木質(zhì)纖維生物煉制丁醇汽油及聚乳酸生物塑料技術(shù)引進(jìn)”（2011-4-13）

王義強(qiáng)，教授，博導(dǎo)，E-mail：wangyiqiang12@163.com

王義強(qiáng)，王啟業(yè)，華連灘，等. 高產(chǎn)丁醇菌株誘變選育及發(fā)酵研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015, 35(10)：120-126,133.

[本文編校：吳 彬]