貯藏過程中酸敗引起的米糠谷蛋白功能性質(zhì)變化

吳 偉 葉建芬 蔡勇建 林親錄（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

中國米糠資源豐富，近年米糠年產(chǎn)量在1 400萬t以上［1］。米糠蛋白約占米糠重量的12%～16%［1］，因其具有低過敏性、高營養(yǎng)價(jià)值和合理的氨基酸組成等優(yōu)點(diǎn)而備受矚目［2，3］。米糠蛋白中約含22%的谷蛋白，米糠谷蛋白主要由多肽鏈彼此通過二硫鍵連接而成，是米糠蛋白中主要的不溶性貯藏蛋白［2，4，5］。蛋白質(zhì)溶解性是影響蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的關(guān)鍵因素［6］，現(xiàn)有研究多從酶法改性［4］、糖基化改 性［5］等 角度來改善谷蛋白功能性質(zhì)，忽略了其在加工貯藏過程中可能發(fā)生的不良變化。

稻谷輾米后米糠中脂質(zhì)與脂肪水解酶和氧化酶的接觸面積迅速擴(kuò)大而產(chǎn)生大量游離脂肪酸，導(dǎo)致米糠酸敗［7］。雖然中國稻谷加工廠數(shù)量多，但整體加工規(guī)模小、分散不均勻，而且米糠穩(wěn)定化設(shè)備多、投資大、生產(chǎn)成本高［8］，僅少部分企業(yè)探尋“一分散，兩集中”的生產(chǎn)模式集中處理米糠及其制品［7］。因而米糠在集中穩(wěn)定化之前需進(jìn)行貯藏，貯藏過程中米糠酸敗產(chǎn)生的游離脂肪酸極易氧化［8，9］，氧化形成的脂質(zhì)自由基和脂質(zhì)活性氧化產(chǎn)物可修飾蛋白質(zhì)的主鏈和側(cè)鏈基團(tuán)，導(dǎo) 致 蛋 白 質(zhì) 氧 化［10，11］，進(jìn) 而 引 起 蛋 白 質(zhì) 功 能 性 質(zhì) 改變［10，12］，目前尚未見米糠酸敗導(dǎo)致米糠蛋白氧化的報(bào)道。本研究擬將新鮮米糠置于25℃、相對(duì)濕度85%條件下貯藏不同天數(shù)，采用不同酸敗程度的米糠為原料脫脂制備米糠谷蛋白，研究米糠谷蛋白功能性質(zhì)在酸敗期間的變化規(guī)律，為充分利用米糠蛋白資源和提高米糠綜合利用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮米糠、大豆油：湖南糧食集團(tuán)有限責(zé)任公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、2，4－二硝基苯肼、十二烷基硫酸鈉（SDS）：分析純，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高速落地離心機(jī)：Sorvall LYNX 6000型，美國Thermo Fisher公司；

冷凍干燥機(jī)：FD5－4型，美國GOLD－SIM公司；

冷凍水浴恒溫振蕩器：SHA－2A型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

高速分散均質(zhì)機(jī)：FA25型，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；

可見分光光度計(jì)：722型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米糠預(yù)處理 將新鮮米糠過40目篩除雜質(zhì)，隨后置于25℃、相對(duì)濕度85%的恒溫培養(yǎng)箱中，分別于貯藏0，1，3，5，10d時(shí)取出得到不同酸敗程度的米糠，根據(jù)文獻(xiàn)［13］制備脫脂米糠。

1.3.2 米糠谷蛋白的制備 根據(jù)文獻(xiàn)［4］，修改如下：采用Osborne分級(jí)方法，將脫脂米糠以料液比1∶8（m∶V）與去離子水混合，在40℃條件下攪拌4h后將懸浮液于4℃8 000r/min離心20min；將沉淀繼續(xù)以料液比1∶8（m∶V）與去離子水混合，在40℃條件下用2mol/L NaOH調(diào)pH值至9.5，攪拌4h后將懸浮液于4℃8 000r/min離心20min，取上清液用2mol/L HCl調(diào)pH至4.6，靜置20min后于4℃8 000r/min離心15min，水洗沉淀3次，取蛋白沉淀分散于去離子水中，并用2mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。最后于4℃8 000r/min離心30min除去少量雜質(zhì)，冷凍干燥得到米糠谷蛋白。

1.3.3 米糠谷蛋白羰基含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［10］。

1.3.4 米糠谷蛋白溶解性、持水性、持油性的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［14］。

1.3.5 米糠谷蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［12］，修改如下：準(zhǔn)確稱量0.2g米糠谷蛋白樣品置于已加入0.05mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液20mL的50mL燒杯中。使用高速分散均質(zhì)機(jī)以10 000r/min均質(zhì)30s，連續(xù)3次約2min，測(cè)量均質(zhì)后的液面體積（記為V0），靜置30min后再次讀取液面體積（記為V30）。按式（1）和（2）分別計(jì)算米糠谷蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性：

式中：

FC——米糠谷蛋白起泡能力，%；

FS——米糠谷蛋白泡沫穩(wěn)定性，%；

V0——均質(zhì)后液面體積，mL；

V30——靜置30min后液面體積，mL。

1.3.6 米糠谷蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［12］，修改如下：將米糠谷蛋白樣品溶解于去離子水中，調(diào)整蛋白濃度為1mg/mL。取1mg/mL蛋白溶液15mL與5mL大豆油混合于100mL燒杯中，于10 000r/min均質(zhì)2min后立即取樣。取20μL米糠谷蛋白—大豆油乳狀液與5mL 0.1%SDS均勻混合，以0.1%SDS為空白，在500nm處測(cè)定吸光值（記為A0）。乳狀液靜置30min后采用相同的方法測(cè)定乳狀液吸光值（記為A30）。按式（3）和（4）分別計(jì)算米糠谷蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性：

式中：

EAI——米糠谷蛋白乳化性，m2/g；

ESI——米糠谷蛋白乳化穩(wěn)定性，min；

A0——空白吸光值；

A30——30min后乳狀液吸光值；

N——稀釋倍數(shù)，250；

C——樣品溶解液中蛋白質(zhì)濃度，0.001g/mL；

φ——油相所占的分?jǐn)?shù)，0.25。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過程中米糠谷蛋白羰基含量的變化

圖1 貯藏過程中米糠谷蛋白羰基含量的變化Figure 1 Changes of carbonyl content of rice bran glutelin during storage

蛋白質(zhì)羰基含量是現(xiàn)階段評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)氧化程度最常用的指標(biāo)［15］。由圖1可知，隨著米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠谷蛋白羰基含量明顯上升，表明米糠谷蛋白在貯藏過程中發(fā)生了氧化。吳大偉等［15］發(fā)現(xiàn)脫脂豆粕在常溫貯藏過程中會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)誘使蛋白氧化，使得蛋白羰基含量增加。米糠貯藏期間米糠谷蛋白羰基含量變化的原因可能是貯藏期間米糠發(fā)生不同程度的酸敗［9］，酸敗后的米糠極有可能發(fā)生類似于脫脂豆粕的脂質(zhì)氧化反應(yīng)，這些脂質(zhì)氧化產(chǎn)物可誘使米糠中谷蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化性修飾［10，11］，使得米糠谷蛋白羰基化，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白羰基含量增加。

2.2 貯藏過程中米糠谷蛋白溶解性的變化

由圖2可知，隨著米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠谷蛋白溶解性顯著下降，降幅接近40%，表明米糠谷蛋白在貯藏過程中形成了不可溶性聚集體。Khan等［16］發(fā)現(xiàn)米糠蛋白溶解性主要與蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞、聚集體的形成及交聯(lián)程度有關(guān)；李彤等［14］發(fā)現(xiàn)米谷蛋白在貯藏過程中溶解性下降的原因是巰基氧化形成二硫鍵，高分子量聚集體增加。米糠貯藏期間米糠谷蛋白溶解性的下降也可能與聚集體的形成有關(guān)，因?yàn)槊卓匪釘‘a(chǎn)生的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物可誘使蛋白質(zhì)氧化［10，12］，使得米糠谷蛋白聚集，引起溶解性下降。米糠谷蛋白的低溶解性限制了蛋白分子在氣—液界面和油—水界面的性質(zhì)，進(jìn)而制約了米糠谷蛋白在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用［6］。

圖2 貯藏過程中米糠谷蛋白溶解性的變化Figure 2 Changes of solubility of rice bran glutelin during storage

2.3 貯藏過程中米糠谷蛋白持水性的變化

由圖3可知，隨著米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠谷蛋白持水性先上升后下降，貯藏3d后達(dá)到最大值，為212.61%。Khan等［16］發(fā)現(xiàn)米糠蛋白持水性的變化與蛋白結(jié)構(gòu)以及疏水/親水基團(tuán)分布情況有關(guān)；李彤等［14］發(fā)現(xiàn)米谷蛋白疏水基團(tuán)的暴露以及聚集體的形成會(huì)制約蛋白質(zhì)的水合能力，進(jìn)而改變疏水/親水基團(tuán)的分布情況。米糠在貯藏過程中極易酸敗，酸敗過程中產(chǎn)生的游離脂肪酸氧化形成脂質(zhì)自由基和活性次生脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，誘使米糠谷蛋白氧化［10，11］；貯藏初期谷蛋白氧化程度較低，蛋白結(jié)構(gòu)局部展開并逐漸改變蛋白內(nèi)部疏水/親水基團(tuán)分布，使得較多水分進(jìn)入蛋白內(nèi)部，進(jìn)而增加了持水性；隨著米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠谷蛋白內(nèi)部大量暴露的疏水基團(tuán)以疏水相互作用形成不可溶性聚集體，再次改變蛋白內(nèi)部的疏水/親水基團(tuán)分布情況，進(jìn)而導(dǎo)致米糠谷蛋白持水性下降。

圖3 貯藏過程中米糠谷蛋白持水性的變化Figure 3 Changes of water holding capacity of rice bran glutelin during storage

2.4 貯藏過程中米糠谷蛋白持油性的變化

由圖4可知，隨著米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠谷蛋白持油性先上升后下降，貯藏1d后達(dá)到最大值，為657.25%。Zhang Hui－juan等［17］發(fā)現(xiàn)疏水性高低會(huì)影響米糠蛋白與脂質(zhì)的結(jié)合能力，且疏水性較低的蛋白分子對(duì)脂質(zhì)吸附的能力較差；吳偉等［12］發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物誘使大豆蛋白氧化產(chǎn)生的不可溶性聚集體是導(dǎo)致蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合能力下降的主要原因。米糠貯藏初期谷蛋白持油性上升可能與谷蛋白表面疏水基團(tuán)的暴露有關(guān)，暴露的疏水基團(tuán)增加了谷蛋白對(duì)脂質(zhì)的吸附能力，使得米糠谷蛋白持油性上升；隨著貯藏時(shí)間的延長，米糠酸敗加劇了米糠谷蛋白氧化，致使大量暴露的疏水基團(tuán)形成不可溶性聚集體，降低了米糠谷蛋白與脂質(zhì)的結(jié)合能力，導(dǎo)致米糠谷蛋白持油性降低。

圖4 貯藏過程中米糠谷蛋白持油性的變化Figure 4 Changes of oil holding capacity of rice bran glutelin during storage

2.5 貯藏過程中米糠谷蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的變化

具有良好溶解性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)可降低蛋白質(zhì)表面張力，使之迅速在氣—液界面充分展開而形成兼具粘彈性和空氣阻隔性的連續(xù)蛋白膜，從而展現(xiàn)出良好的起泡特性［6，16］，而蛋白質(zhì)氧化則會(huì)導(dǎo)致蛋白溶解性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降［12］。由圖5可知，隨著米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠谷蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性先上升后下降，分別在貯藏1d和3d后達(dá)到最大值，為75.06%和69.30%。米糠貯藏過程中酸敗產(chǎn)生的游離脂肪酸極易氧化，形成的活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物可導(dǎo)致米糠谷蛋白氧化［10，11］，進(jìn)而影響米糠谷蛋白起泡性質(zhì)。貯藏初期谷蛋白氧化程度較低，蛋白分子結(jié)構(gòu)部分展開，易使蛋白分子吸附至氣—液界面而形成粘彈性和阻隔性良好的連續(xù)蛋白膜，使得起泡性質(zhì)增加；隨著米糠谷蛋白氧化程度的加深，不斷暴露的疏水基團(tuán)形成不可溶聚集體，既改變了蛋白分子的表面張力，也降低了氣—液界面的穩(wěn)定性，導(dǎo)致起泡能力和泡沫穩(wěn)定性顯著下降。

圖5 貯藏過程中米糠谷蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的變化Figure 5 Changes of foaming capacity and foaming stability of rice bran glutelin during storage

2.6 貯藏過程中米糠谷蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的變化

由圖6可知，隨著米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠谷蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性先上升后下降，分別在貯藏1d和3d后達(dá)到最大值，為76.27m2/g和20.60min。Zhang Hui－juan等［17］發(fā)現(xiàn)疏水性較低的米糠蛋白吸附脂質(zhì)的能力有限，乳化性質(zhì)較差；尤夢(mèng)圓等［6］發(fā)現(xiàn)親水親油基團(tuán)的暴露有利于脂質(zhì)的吸附，進(jìn)而形成穩(wěn)定的油—水界面；吳偉等［12］發(fā)現(xiàn)蛋白氧化后蛋白分子與脂質(zhì)的結(jié)合能力降低，且油—水界面的穩(wěn)定性逐漸喪失。貯藏期間米糠谷蛋白乳化性質(zhì)的變化可能與持油性和疏水基團(tuán)有關(guān)，貯藏初期蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)逐漸暴露，增加了蛋白分子對(duì)脂質(zhì)的吸附能力，使得更多親油基團(tuán)吸附至油—水界面而增強(qiáng)了米糠谷蛋白的乳化性質(zhì)；隨著貯藏時(shí)間的延長，之前大量暴露的疏水基團(tuán)逐漸聚集形成不可溶性聚集體，降低了米糠谷蛋白對(duì)脂質(zhì)的吸附能力，油—水界面的穩(wěn)定性也隨之下降，因而米糠谷蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性降低。

圖6 貯藏過程中米糠谷蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的變化Figure 6 Changes of emulsion activity and emulsion stability of rice bran glutelin during storage

3 結(jié)論

將新鮮米糠貯藏不同天數(shù)后脫脂制備米糠谷蛋白，研究貯藏過程中酸敗引起的米糠谷蛋白功能性質(zhì)的變化。結(jié)果表明：米糠谷蛋白在貯藏過程中發(fā)生了氧化，且貯藏時(shí)間越長谷蛋白氧化程度越深；米糠谷蛋白溶解性隨貯藏時(shí)間延長而下降，表明米糠谷蛋白在貯藏期間形成了不可溶性聚集體；米糠谷蛋白持水性、持油性、起泡性和乳化性在貯藏期間的變化趨勢(shì)均先上升后下降，其中持油性、起泡能力和乳化性在貯藏1d后升至最大，米糠谷蛋白持水性、泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性在貯藏3d后升至最大。由此可見，米糠在貯藏過程中酸敗產(chǎn)生的游離脂肪酸會(huì)氧化形成活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致米糠谷蛋白氧化，進(jìn)而影響米糠谷蛋白功能性質(zhì)。貯藏過程中米糠酸敗所引起的米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)變化有待進(jìn)一步研究。

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