響應(yīng)面試驗優(yōu)化新疆阿魏根多糖微波輔助提取工藝及其體外抗氧化活性

劉 杰，李雅雙，包 瑛，劉春蘭,3,*

（1.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；3.北京市食品環(huán)境與健康工程技術(shù)研究中心，北京 100081）

響應(yīng)面試驗優(yōu)化新疆阿魏根多糖微波輔助提取工藝及其體外抗氧化活性

劉 杰1,2，李雅雙1，包 瑛1，劉春蘭1,3,*

（1.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；3.北京市食品環(huán)境與健康工程技術(shù)研究中心，北京 100081）

為了獲得微波提取新疆阿魏根多糖的最佳工藝，以及新疆阿魏粗多糖的體外抗氧化活性，采用響應(yīng)面法優(yōu)化新疆阿魏水溶性多糖的微波提取工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上選取液料比、提取溫度、提取時間、微波功率進(jìn)行試驗設(shè)計，以所得多糖質(zhì)量與苯酚硫酸法測得的多糖含量百分?jǐn)?shù)的乘積作為優(yōu)化指標(biāo)，并檢測新疆阿魏根多糖體外清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的活性。結(jié)果：最優(yōu)工藝條件為液料比120∶1（mL/g）、提取時間13 min、提取溫度80 ℃、微波功率600 W，多糖實(shí)際得率為6.93%，接近于理論值。新疆阿魏根多糖對DPPH自由基有很好的清除作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，新疆阿魏根多糖對DPPH自由基的清除率為91.67%，作用接近于VC的清除作用。

新疆阿魏；多糖；響應(yīng)面法；提取工藝；抗氧化

新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K. M. Shen）是傘形科（Umbelliferae）阿魏屬（Ferula）多年生草本植物，全株和果實(shí)散發(fā)著強(qiáng)烈蔥蒜樣異臭味。新疆阿魏非常局限地分布于新疆伊犁地區(qū)（白石墩）狹小地點(diǎn)，生長于山前荒漠和帶礫石的黏質(zhì)土坡[1]，乳汁可入藥，即為阿魏藥材。其根也有治療作用，常用于民族醫(yī)藥[2]。新疆阿魏或阜康阿魏（Ferula fukanensis）樹脂俗稱阿魏（膠），是我國重要傳統(tǒng)中藥材，阿魏味苦、辛，性溫，歸脾、胃經(jīng)，有消積、散脾、殺蟲的功效。用于治療肉食積滯，瘀血痞塊，蟲積腹痛等癥[3]，具有極高的藥用價值。阿魏膠還是治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胃病的良藥，在新疆民族藥中用的較多。

多糖是一種天然高分子化合物，由醛糖或酮糖通過糖苷鍵聚合而成，廣泛存在于動物、植物和微生物（細(xì)菌和真菌）中，最早研究的為莢膜多糖，主要應(yīng)用于疫苗[4]。20世紀(jì)70年代以來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多糖及多糖復(fù)合物參與了細(xì)胞生命的代謝和調(diào)節(jié)，中草藥多糖能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，在抗腫瘤、抗肝炎、抗?jié)?、調(diào)血脂、降血糖、抗衰老方面均有作用[5]，且毒副作用小、不易殘留[6-7]。

微波提取是一種常用提取天然植物有效成分的技術(shù)，具有快速、高效、安全、節(jié)能、有效成分得率高等特點(diǎn)[8]。響應(yīng)面法可以對影響過程的因素及其交互作用進(jìn)行綜合評價[9]。

鄧衛(wèi)萍等[5]采用苯酚硫酸法對新疆阿魏的總糖含量進(jìn)行了測定，并未做進(jìn)一步研究，其他有關(guān)新疆阿魏根多糖的研究鮮有報道。本實(shí)驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取新疆阿魏根多糖的工藝條件，并對新疆阿魏根多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行初步探究，為新疆阿魏資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆阿魏根 新疆烏魯木齊市藥材公司。

乙醇、乙醚、硫酸（分析純）、苯酚（分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖 上海國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

XH-100B電腦微波催化合成/萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；QE-200克四兩裝高速中藥粉碎機(jī) 浙江屹立工貿(mào)有限公司；ZK-2S電熱真空干燥箱 天津市中環(huán)電爐有限公司；2-4LCS凍干機(jī) 德國Christ公司；LD4-8型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；BS224S電子天平德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UV-Jasco53型紫外分光光度計 日本島津公司；Benchmark plus酶標(biāo)儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 新疆阿魏根多糖的提取

提取工藝流程：新疆阿魏根→60 ℃干燥24 h→粉碎，過40 目篩→脫脂→微波萃取儀中提取→抽濾→濃縮→真空凍干（-85 ℃，1.4×10-3Mbar）。

1.3.2 新疆阿魏根多糖得率的測定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[10]

將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于105 ℃烘至恒質(zhì)量，準(zhǔn)確稱取50 mg于1 000 mL容量瓶中，定容。分別取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL于試管中，依次補(bǔ)水至2 mL，以水為空白對照，分別加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚1 mL、濃硫酸5 mL，搖勻后室溫靜置20 min，于490 nm波長處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 多糖含量及得率測定

配制50 μg/mL糖溶液，加入5%苯酚1 mL、濃硫酸5 mL，于490 nm波長處測吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算糖含量。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

通過預(yù)實(shí)驗，選取液料比、提取時間、提取溫度、微波功率4 個對多糖得率影響比較明顯的條件進(jìn)行單因素試驗，采用微波輔助水提法提取新疆阿魏根多糖，測定糖含量，并計算新疆阿魏根多糖的得率。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計[11-12]

在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken試驗設(shè)計，并運(yùn)用響應(yīng)面軟件（Design-Expert 8.0.6）進(jìn)行試驗分析。分別以X1、X2、X3、X4表示4 個因素，以-1、0、1表示各因素的3 個水平，試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table1 Factors and their coded Levels used in RSM

1.3.5 精制多糖的體外抗氧化實(shí)驗

將得到的干燥新疆阿魏根多糖復(fù)溶、醇沉、干燥，再次得到的多糖進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗。進(jìn)行新疆阿魏根水溶性多糖清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基活性的測定[13-14]。

配制不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，分別取50 μL的無水乙醇和DPPH溶液于96 微孔板的不同微孔中，各加入50 μL多糖溶液，避光30 min，于525 nm波長酶標(biāo)儀測得吸光度分別為Ai、Aj。以VC為陽性對照，與多糖做相同處理。50 μL DPPH和50 μL無水乙醇混合作為空白對照，測得吸光度為A0。根據(jù)式（2）計算多糖對DPPH自由基的清除率。

以上實(shí)驗中每一水平均做3 次重復(fù)實(shí)驗，以減小實(shí)驗誤差對實(shí)驗結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.011 1x-0.074 4，R2=0.999 3。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 液料比對新疆阿魏根多糖得率的影響

在微波功率600 W、提取溫度70 ℃、提取時間10 min的條件下，設(shè)定液料比分別為30∶1、50∶1、80∶1、100∶1、130∶1（mL/g），考察液料比對新疆阿魏根多糖得率的影響。

圖1 液料比對多糖得率的影響Fig.1 Effects of radio of water to material on polysaccharide yield

如圖1所示，隨著液料比的增加，新疆阿魏根多糖的得率呈明顯的上升趨勢，當(dāng)液料比達(dá)到80∶1～100∶1（mL/g）之間時，多糖得率最高，繼續(xù)提高液料比，多糖得率不升反降，推測是由于多糖高溫分解或雜質(zhì)質(zhì)量濃度的升高影響了多糖的溶出和醇沉。

2.2.2 提取時間對新疆阿魏根多糖得率的影響

在微波功率600 W、提取溫度70 ℃、液料比80∶1（mL/g）的條件下，設(shè)定提取時間分別為5、10、15、20、25 min，考察提取時間對新疆阿魏根多糖得率的影響。

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effects of extraction period on polysaccharide yield

如圖2所示，在提取時間為10 min左右時，多糖得率最高，隨著提取時間的延長，多糖的得率下降明顯，推測是由于微波作用時間延長，多糖部分降解。

2.2.3 提取溫度對新疆阿魏根多糖得率的影響

在微波功率600 W、提取時間10 min、液料比80∶1（mL/g）的條件下，設(shè)定提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃，考察提取溫度對新疆阿魏根多糖得率的影響。

圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on polysaccharide yield

如圖3所示，隨著溫度的升高，多糖得率呈上升趨勢，但是由于溫度過高對多糖具有破壞作用，未設(shè)置更高提取溫度。

2.2.4 微波功率對新疆阿魏根多糖得率的影響

在提取溫度80 ℃、提取時間10 min、液料比80∶1（mL/g）的條件下，設(shè)定微波功率分別為400、500、600、700、800 W，考察微波功率對新疆阿魏根多糖得率的影響。

圖4 微波功率對多糖得率的影響Fig.4 Effects of microwave power on polysaccharide yield

如圖4所示，當(dāng)微波功率為600 W時，多糖得率最高。推測微波功率低于600 W時，微波穿透細(xì)胞壁的作用力小，導(dǎo)致部分多糖未能溶出；而微波功率高于600 W時，部分多糖降解，降解生成的單糖或寡糖更容易被一些雜質(zhì)吸附，離心后與雜質(zhì)一起被除去，因此在微波功率600 W時多糖得率最高。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取液料比、提取時間、提取溫度、微波功率進(jìn)行四因素三水平試驗分析（表2）。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table2 Process variable and levels in response surface design arrangement and experimental response values

2.3.2 回歸模型有效性及顯著性分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2響應(yīng)面方案及結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，對回歸模型進(jìn)行方差分析，并檢驗回歸方程系數(shù)的顯著性（表3）。

表3 回歸模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table3 Analysis of variance of regression equation and signifi cance test for regression coeffi cients

分析得到的二元回歸方程如下：

Y/%=6.74＋0.22X1＋0.13X2＋0.35X3＋0.12X4＋

剔除上述方程式中的不顯著項，得到新疆阿魏根多糖得率的公式如下：

方差分析結(jié)果（表3）顯示回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），該回歸模型的調(diào)整確定系數(shù)為0.956 6，及該模型可以解釋95.66%的變化，說明用此模型對新疆阿魏根多糖得率進(jìn)行的分析和預(yù)測是有效的。

由方差分析（表3）可知，液料比與提取時間之間的交互作用極顯著，而其他5 種組合類型的因素交互作用不顯著。各組合類型的兩種因素交互作用形成的響應(yīng)面如圖5所示，每個組合中其他兩種因素固定在0水平。

圖5 各因素交互作用對多糖得率影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surfaces showing the interactive effects of independent variables on polysaccharide yield

如圖5a所示，由等高線圖可以看出提取時間的坐標(biāo)軸所對應(yīng)的等高線相對于液料比的坐標(biāo)軸要密集，提取時間比液料比對多糖得率的影響大[15]；由方差分析結(jié)果（表3）已知液料比和提取時間的交互作用極顯著。如圖5b所示，從等高線圖可以看出提取溫度的坐標(biāo)軸對應(yīng)的等高線較液料比的坐標(biāo)軸要密集，提取溫度比液料比對多糖得率的影響大；從曲面圖可以看出，隨著提取溫度和液料比水平的增加多糖得率均先增加后平穩(wěn)，由于材料中多糖含量的關(guān)系，多糖得率不會隨著條件的優(yōu)化而無限制的提高，而且過高的溫度對多糖本身也有分解破壞的不利影響[16]；液料比過大會增加濃縮的時間和成本，也會增加其他雜質(zhì)的含量，雜質(zhì)可能會吸附多糖，在濃縮和離心的過程中也會造成多糖的損失；液料比與提取溫度的交互作用不顯著（表3）。圖5c中，隨著微波功率的增加（500～700 W）多糖得率先增加后降低，因為微波功率過大對多糖具有分解作用；由等高線圖可知，微波功率對多糖得率的影響大于液料比；液料比與微波功率的交互作用不顯著（表3）。圖5d中，隨著提取時間的變化（5～10 min）多糖得率先升高后降低。微波作用時間過長對多糖也有一定的分解作用，故并不是提取時間越長多糖得率越高。由等高線圖可知，提取溫度對多糖得率的影響大于提取時間的影響；提取溫度與提取時間的交互作用不顯著（表3）。由圖5e、f的等高線圖可以直觀看出，微波功率與提取時間的交互作用比微波功率與提取溫度的交互作用要好，且提取溫度和提取時間對多糖得率的影響均比微波功率的影響大；但從方差分析[17-19]（表3）的結(jié)果可知，微波功率與提取時間和提取溫度的交互作用均不顯著（P＞0.05）。

根據(jù)回歸模型的分析結(jié)果[20-22]，得到理論最優(yōu)工藝條件為液料比119.13∶1（mL/g）、提取時間12.96 min、提取溫度83.87℃、微波功率586.72 W，該條件下多糖得率的預(yù)測值為6.97%?？紤]到實(shí)際操作及儀器設(shè)置的限制，將微波提取的工藝條件稍作修正：液料比120∶1（mL/g）、提取時間13 min、提取溫度80 ℃、微波功率600 W。3 次平行實(shí)驗驗證此條件，得到新疆阿魏根多糖實(shí)際得率的平均值為6.93%，接近于多糖得率的預(yù)測值。而采用直接水提醇沉法，3 次平行實(shí)驗得到新疆阿魏根多糖實(shí)際得率為2.38%，說明采用響應(yīng)面方法優(yōu)化多糖微波提取工藝的參數(shù)條件是可行的。且在后續(xù)酶法結(jié)合Sevag法脫蛋白實(shí)驗中，采用微波輔助水提和凍干的多糖比水提醇沉和常規(guī)干燥的多糖更容易脫去蛋白質(zhì)，因此也減少有機(jī)溶劑對多糖的破壞[23-24]。

2.4 新疆阿魏根多糖的體外抗氧化活性

圖6 新疆阿魏根多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of the crude polysaccharides on DPPH free radicals

如圖6所示，新疆阿魏根多糖對DPPH自由基有清除作用，在質(zhì)量濃度范圍為100～1 000 μg/mL，新疆阿魏根多糖隨質(zhì)量濃度增加，對DPPH自由基的清除作用也增強(qiáng)。當(dāng)多糖和VC的質(zhì)量濃度均為100 μg/mL時，清除率分別為67.29%、85.42%；當(dāng)多糖和VC的質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 μg/mL時，清除率分別為91.67%、98.75%，新疆阿魏根多糖與VC對DPPH自由基的清除作用非常接近。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗選取液料比、提取溫度、提取時間、微波功率4 個因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，通過回歸模型的方差分析結(jié)果可知各因素對多糖得率的影響均顯著，其影響順序為提取溫度＞液料比＞提取時間＞微波功率。響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取新疆阿魏水溶性多糖的最佳工藝條件為：液料比120∶1（mL/g）、提取時間13 min、提取溫度80 ℃、微波功率600 W。新疆阿魏根多糖實(shí)際得率為6.93%，接近于多糖得率的預(yù)測值。

體外抗氧化實(shí)驗結(jié)果顯示，新疆阿魏根多糖對DPPH自由基有很好的清除作用，與VC抗氧化性相當(dāng)。鑒于新疆阿魏根多糖的抗氧化活性，可以嘗試應(yīng)用于開發(fā)相關(guān)保健品、藥物及化妝品等[25]。

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Extraction Optimization of Polysaccharides from the Roots of Ferula sinkiangensis K. M. Shen and Their Antioxidant Activities in Vitro

LIU Jie1,2, LI Yashuang1, BAO Ying1, LIU Chunlan1,3,*
(1. College of Life and Environmental Science, Minzu Univirsity of China, Beijing 100081, China; 2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China; 3. Beijing Engineering Research Center of Food Environment and Public Health, Beijing 100081, China)

This study aimed to obtain the optimum microwave-assisted extraction process for polysaccharides from the roots of Ferula sinkiangensis K. M. Shen and to examine the antioxidant activity of the crude polysaccharides in vitro. The response surface methodology (RSM) was used to optimize the extraction process. Liquid/solid ratio, extraction temperature, extraction time, microwave power were selected as independent variables on the basis of single factor experiments. The yield of purifi ed polysaccharides was chosen as the response variable. The optimum conditions for microwave-assisted extraction were determined as follows: liquid/solid ratio, 120:1 (mL/g); extraction temperature, 80 ℃; extraction time, 13 min; and microwave power, 600 W. Experiments done under these conditions resulted in an extraction yield of 6.93%, agreeing with the predicted value. The crude polysaccharides extracted from the roots of Ferula sinkiangensis K. M. had a potent scavenging effect on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radicals, and could scavenge 91.67% of the free radicals at 1 000 μg/mL, which was close to that of VC.

Ferula sinkiangensis K. M. Shen; polysaccharides; response surface methodology; extraction process; antioxidant activity

Q946.3

A

1002-6630（2015）22-0057-06

10.7506/spkx1002-6630-201522010

2015-03-26

中央民族大學(xué)“985”工程項目（MUC985-9）；“111創(chuàng)新引智計劃”工程項目（B08044）；

準(zhǔn)格爾北部生態(tài)保育技術(shù)集成與示范項目（2014BAC15B04）

劉杰（1989—），女，碩士研究生，研究方向為植物多糖化學(xué)。E-mail：liujie19890215@163.com

*通信作者：劉春蘭（1962—），女，教授，碩士，研究方向為多糖化學(xué)。E-mail：13520669416@163.com