芝麻油脫臭餾出物中甾醇的兩種提取工藝優(yōu)化

馬素?fù)Q 汪學(xué)德 李夢華

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

植物甾醇是一種重要的生理活性物質(zhì)，對人的生理作用非常有益，它是植物油中一種重要的不皂化物。脫臭餾出物中含10%～30%的不皂化物，其中40%左右為甾醇［1－3］，因此多從脫臭餾出物中提取甾醇。常規(guī)的化學(xué)提取方法雖設(shè)備簡單，但耗費(fèi)溶劑量大，生產(chǎn)廢料多，能量消耗大；新型超臨界流體萃取法，環(huán)保干凈，提取率高，但很多分子結(jié)構(gòu)比較接近的物質(zhì)會同時(shí)被萃取出來，造成產(chǎn)品純度低［4－7］。本研究擬針對以上兩種方法缺點(diǎn)，以芝麻油脫臭餾出物為原料，參照前人［8，9］研究的結(jié)果，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交方法分別對溶劑法和超臨界CO2法兩種方法進(jìn)行了工藝優(yōu)化，使其更能廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)上和實(shí)驗(yàn)室研究中，也以期為芝麻油脫臭餾出物的開發(fā)利用以及植物甾醇的生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器設(shè)備

超臨界CO2設(shè)備：Helix-7409型，美國應(yīng)用分離公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975C型，美國Agilent公司；

分析天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

可見分光光度計(jì)：722N型，上海精科公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHZ-DⅢ型，鞏義予華有限責(zé)任公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

恒溫干燥箱：XMTD-8222型，上海精宏設(shè)備有限公司；

恒溫水浴鍋：XMTE-8112型，北京市永光明醫(yī)療廠。

1.1.2 試劑

氫氧化鉀、石油醚：分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；

無水乙醇：分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；

正己烷：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

谷甾醇：純度＞75%，Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司；

1.2 溶劑法提取單因素試驗(yàn)

（1）皂化時(shí)間對甾醇提取率的影響：在皂化溫度85℃，加堿量7.5mL/0.5g，皂化時(shí)間1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.5h下考察皂化時(shí)間對甾醇提取率的影響。

（2）皂化溫度對甾醇提取率的影響：在皂化時(shí)間3.5h，加堿量7.5mL/0.5g，皂化溫度65，70，75，85，90，95℃下考察皂化溫度對甾醇提取率的影響。

（3）加堿量對甾醇提取率的影響：在皂化時(shí)間3.5h，皂化溫度85℃，加堿量5.0，6.5，7.5，8.5，10.0mL/0.5g下考察加堿量對甾醇提取率的影響。

單因素試驗(yàn)采用以下試驗(yàn)操作進(jìn)行，以植物甾醇質(zhì)量濃度為考察指標(biāo)，每次試驗(yàn)做3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

試驗(yàn)操作：準(zhǔn)確稱取0.5g脫臭餾出物于錐形瓶中，加入一定量2mol/L KOH—無水乙醇溶液，劇烈振搖。在一定的溫度下進(jìn)行水浴皂化，皂化時(shí)間到達(dá)后加入5mL蒸餾水，使其停止皂化，取出錐形瓶，冷卻至室溫，加入5mL正己烷，進(jìn)行萃取，避免劇烈搖晃而致使乳化，用同樣量正己烷同樣步驟萃取3次。

合并3次萃取液，加蒸餾水水洗至中性，加入一定的無水硫酸鈉，放置一段時(shí)間除出殘留水分，將萃取液倒入圓底燒瓶中，旋蒸除去溶劑［10－12］。用少量無水乙醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，定容。

用移液槍取出2mL于玻璃試管中，再各加入2mL無水乙醇和2mL顯色劑，在渦旋混合器上渦旋30s，靜置，顯色15min后測吸光度。吸光度測定借鑒參考文獻(xiàn)［9］。

1.3 超臨界CO2法提取

1.3.1 工藝流程

芝麻油脫臭餾出物→稱量上樣→超臨界CO2動靜態(tài)結(jié)合萃取→餾出物萃取率分析

1.3.2 植物甾醇萃取率計(jì)算 按式（1）進(jìn)行。

1.3.3 萃取法單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在CO2流量為20L/h，萃取壓力為25MPa，萃取溫度為50℃，萃取時(shí)間為2.5h的基礎(chǔ)上從CO2流量、萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間4個(gè)因素去考查對甾醇提取率的影響［8］，各因素水平見表1。

表1 SCF－CO2萃取試驗(yàn)因素水平表Table 1 SCF－CO2extraction experiment factors level table

1.3.4 氣質(zhì)色譜分析條件

（1）色譜條件：HP-5毛細(xì)管色譜柱（30m×250μm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度280℃；不分流；流速1.2mL/min；升溫程序：90℃保持1min，以30℃/min的速率升溫至270℃，保持1min，以3℃/min的速率升溫至300℃，保持12 min；進(jìn)樣量1μL。

（2）MS條件：傳輸線溫度250℃，離子源溫度220℃，離子化模式為EI，電子能量70eV，分子離子碎片掃描范圍（m/z）50～650。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑法提取甾醇條件的選擇

2.1.1 皂化時(shí)間對甾醇提取的影響 由圖1可知，隨皂化時(shí)間的延長甾醇得率提高，當(dāng)皂化時(shí)間為3.5h時(shí)甾醇得率最高，為7.11%，但是皂化時(shí)間過長得率又會降低，因?yàn)樵砘瘯r(shí)間過長時(shí)會發(fā)生其他化學(xué)反應(yīng)，溶出的物質(zhì)與萃取劑漸漸結(jié)合，一方面影響甾醇的純度，另一方面使最終結(jié)果偏低。而皂化時(shí)間過短時(shí)，皂化會不完全，甾醇不能從脫臭餾出物中完全脫離出來，并且游離脂肪酸、甘油酯等能溶解于正己烷使樣品量偏高，從而使總甾醇含量較低。

圖1 皂化時(shí)間對總甾醇含量的影響Figure 1 Saponification time on the influence of total sterol content

2.1.2 皂化溫度對甾醇提取的影響 由圖2可知，隨皂化溫度的升高甾醇得率增加，從65℃到75℃變化幅度較小，75℃到85℃變化幅度較大，當(dāng)溫度達(dá)到85℃時(shí)得到的甾醇最多，溫度繼續(xù)升高時(shí)甾醇含量降低，且降低速度較快，幅度較大，皂化溫度的影響和皂化時(shí)間的影響相似。這可能是由于溫度較低時(shí)物質(zhì)活性低，不能皂化完全，皂化后溶液顏色加深，呈深褐色，萃取時(shí)溶劑的顏色也很深，為黃褐色，雜質(zhì)進(jìn)入甾醇中使結(jié)果偏低；溫度過高時(shí)又可能使甾醇發(fā)生氧化，總甾醇含量減少。

2.1.3 堿液量對甾醇提取的影響 由圖3可知，隨加堿量的增加總甾醇量增多，加堿量為5.0，6.5mL/0.5g時(shí)差別不大，加堿量從6.5mL/0.5g到8.5mL/0.5g時(shí)甾醇得率增高較快，加堿量為10mL/0.5g比加堿量為8.5mL/0.5g得到的甾醇還要少一些，這是因?yàn)榧訅A量過少時(shí)不能使脫臭餾出物中的甾醇完全脫離出來，甾醇得率較低，若加堿量太高，甾醇損失也較多。為避免試劑的浪費(fèi)和提高產(chǎn)率，應(yīng)將料液比定為8.5mL/0.5g。

圖2 皂化溫度對總甾醇含量的影響Figure 2 Saponification temperature on the influence of total sterol content

圖3 加堿液量對總甾醇含量的影響Figure 3 Alkaline effects on total sterol content

2.2 溶劑法正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對皂化時(shí)間、皂化溫度、堿液量進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

由表3可知，各因素對甾醇提取率影響的先后順序：A＞C＞B，最優(yōu)組合為A2B2C2，而9組試驗(yàn)最佳結(jié)果是8.58%，其組合為A2B1C2總甾醇含量能達(dá)到8.58%，提取率為27.16%，對組合 A2B2C2進(jìn)行驗(yàn)證其總甾醇含量能達(dá)到8.63%，提取率為27.32%，考慮到降低熱量消耗，同時(shí)提取結(jié)果又相對比較好，所以提取甾醇的最佳條件為組合A2B1C2：皂化時(shí)間3.5h，皂化溫度80℃，加堿量8.5mL。時(shí)間越長、溫度越高、堿液量越多，但甾醇得率不一定越好，因?yàn)檫@些條件的提高可能會使原料發(fā)生變化，部分雜質(zhì)溶解在萃取劑中被萃取出來，使甾醇的純度降低，同時(shí)降低了總甾醇含量。

表2 溶劑法正交L9（33）試驗(yàn)因素水平Table 2 Solvent method of L9（33）orthogonal test factors

表3 溶劑法正交L9（33）試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results of solvent method of L9（33）orthogonal test

2.3 超臨界CO2法提取甾醇條件選擇

2.3.1 萃取壓力對甾醇提取的影響 由圖4可知，隨著萃取壓力的不斷升高，甾醇提取率先增高后降低，在萃取壓力為25MPa時(shí)，甾醇提取率最高，然后隨著壓力的增加，提取率反而下降，故選取萃取壓力25MPa。

圖4 萃取壓力對甾醇提取率的影響Figure 4 Extraction pressure impact on sterol extraction

2.3.2 萃取時(shí)間對甾醇提取的影響 由圖5可知，在萃取壓力、溫度和CO2流量一定的條件下，隨著萃取時(shí)間的延長甾醇萃取率有明顯增高的趨勢，超過3h，提取率開始下降。

2.3.3 CO2流量對甾醇提取的影響 由圖6可知，隨著CO2流量的變化，甾醇萃取隨之有明顯的變化，流量大于20 L/h時(shí)，隨著CO2流量的增加呈下降趨勢，CO2流量大時(shí)流速大，會有部分物料隨著CO2帶出，從而導(dǎo)致物料中甾醇的部分損失，所以CO2的流量不能過大。

2.3.4 萃取溫度對甾醇提取的影響 由圖7可知，在相同壓力下，隨著溫度的不斷升高，CO2溶解能力先升高后降低，萃取溫度為50℃時(shí)，甾醇提取率達(dá)最大值。溫度繼續(xù)升高，CO2溶解能力反而變小。

圖5 萃取時(shí)間對甾醇提取率的影響Figure 5 Extraction time impact on sterol extraction yield

圖6 CO2流量對甾醇提取的影響Figure 6 CO2flow impact on sterol extraction

圖7 萃取溫度對甾醇提取率影響Figure 7 Extraction temperature on sterol extraction yield

2.4 超臨界萃取法正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

超臨界CO2萃取法正交因素水平和結(jié)果見表4、5。

表4 超臨界CO2萃取正交L9（34）試驗(yàn)因素水平Table 4 The L9（34）orthogonal experiment test factors for supercritical CO2extraction

表5 超過臨界CO2萃取正交L9（34）試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 The L9（34）orthogonal experiment results for supercritical CO2extraction

由表5可知，各因素甾醇的提取率影響的主次順序?yàn)椋篋＞C＞A＞B，最佳水平組合為A2B1C3D3，對其進(jìn)行驗(yàn)證并與組合A2B1C2D3進(jìn)行比較，結(jié)果為甾醇提取率分別為73.25%和72.69%，故超臨界CO2最佳提取條件為：壓力25 MPa，時(shí)間為2.5h，CO2流量為25L/h，溫度為55℃。

2.5 芝麻油脫臭餾出物中甾醇的組成測定

色譜分析結(jié)果見圖8，3個(gè)主峰依次為菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇。菜油甾醇前面那個(gè)小峰為菜籽甾醇，采用面積歸一化方法，測定了各甾醇組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果為菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、菜籽甾醇含量分別為19.32%，19.16%，42.40%，1.40%，甾醇純度為82.28%。

3 結(jié)論

從芝麻油脫臭餾出物中提取植物甾醇其溶劑法的優(yōu)化工藝條件為：皂化時(shí)間3.5h，皂化溫度80℃，加堿量8.5mL/0.5g；超臨界CO2萃取法優(yōu)化工藝條件為：壓力25 MPa，時(shí)間2.5h，CO2流量25L/h，溫度55℃，此條件下產(chǎn)品的純度為82.28%。

圖8 甾醇?xì)赓|(zhì)色譜Figure 8 GC—MS pattern of standardized phytosterol

溶劑法每個(gè)操作過程會一定程度造成甾醇含量的損失，從試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了溶劑法提取效果不如超臨界CO2萃取法，但SCF—CO2法應(yīng)用成本比溶劑法高，能否降低使用成本將直接影響其在工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，未來將會嘗試用夾帶劑對超臨界萃取過程進(jìn)行強(qiáng)化，進(jìn)一步縮短萃取時(shí)間，降低操作壓力，降低其應(yīng)用成本。

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