指紋分析技術(shù)及其在食品中的應(yīng)用

吳 帥 雷 聲楊錫洪 高 倩程?hào)|偉 張 玲 趙 蔚 張?zhí)鞐澖馊f(wàn)翠

（1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650231）

指紋技術(shù)，起源于生物識(shí)別技術(shù)（20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)，如指紋識(shí)別、面部識(shí)別、聲紋識(shí)別及虹膜識(shí)別等方式［1］），并逐漸發(fā)展成為“指紋圖譜的化學(xué)模式識(shí)別分析技術(shù)”，其核心方法是先通過(guò)物質(zhì)分解（酶解）或者反應(yīng)擴(kuò)增（如PCR擴(kuò)增），然后采取一些分離手段（電泳、層析等）實(shí)現(xiàn)特征性物質(zhì)的分離，最終獲得特征性（指紋）圖譜的一個(gè)過(guò)程。近些年，隨著各種先進(jìn)生物技術(shù)的不斷發(fā)掘，使得指紋技術(shù)在食品領(lǐng)域（如微生物分離鑒定［2］、貨架期預(yù)測(cè)［3］等）的應(yīng)用也越來(lái)越全面，為解決和預(yù)防食品造假、摻雜、食物中毒等食品安全問(wèn)題提供了新的途徑。因此，能夠?qū)⒅讣y分析技術(shù)（圖1）合理的應(yīng)用于食品領(lǐng)域?qū)?huì)促進(jìn)食品行業(yè)的完善［4］。

圖1 常見(jiàn)指紋圖譜技術(shù)Figure 1 Common fingerprint technologies

在食品領(lǐng)域，指紋圖譜分析技術(shù)還處于初期階段，如果能進(jìn)一步探索并更好地應(yīng)用于食品生產(chǎn)和流通中，將大大促進(jìn)食品產(chǎn)業(yè)的規(guī)范化和安全性，并加快傳統(tǒng)及新型食品的開(kāi)發(fā)。

1 指紋技術(shù)應(yīng)用狀況及特點(diǎn)

1.1 DNA指紋分析技術(shù)

DNA指紋分析技術(shù)簡(jiǎn)稱DNA指紋或遺傳指紋技術(shù)，通過(guò)分子標(biāo)記，對(duì)生物個(gè)體間DNA序列差異的檢測(cè)。包括物種特異聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragmentlength polymorphism，AFLP）、微衛(wèi)星 DNA（simple sequence repeat，SSR）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（inter－simple sequence repeat，ISSR）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide poly－morphism，SNP）等 DNA指紋技術(shù)［5］。

徐朝輝等［6］利用RAPD技術(shù)得到了中藥生品牛蒡子（四大商品區(qū)）以及制品牛蒡子（其中兩個(gè)商品區(qū)）的DNA指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)生品牛蒡子圖譜具有一致性，而制品牛蒡子的圖譜與生品之間存在明顯區(qū)別，表明了DNA指紋圖譜在生品藥材方面應(yīng)用的可靠性；陳穎等［7］建立了還原橙汁、摻假橙汁和鮮榨橙汁的PCR快速鑒別方法，有效識(shí)別摻假產(chǎn)品；阮泓越等［8］采用微衛(wèi)星DNA對(duì)豬的個(gè)體識(shí)別和溯源進(jìn)行探索，指出來(lái)自同一頭豬的豬肉和血液DNA是一一對(duì)應(yīng)的，這就表明可以實(shí)現(xiàn)從豬血到豬肉的溯源。DNA指紋技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如不受環(huán)境影響，可以在樣品發(fā)育的任何階段進(jìn)行檢測(cè)，可進(jìn)行大量標(biāo)記，對(duì)于表現(xiàn)出共性的基因型可以鑒別出其是純合型還是雜合型，技術(shù)操作簡(jiǎn)單、迅速、便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，還有就是提取的DNA樣品可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存（條件適宜），有利于追溯性或仲裁性的實(shí)施［5］。

1.2 代謝指紋分析技術(shù)

代謝指紋分析技術(shù)是對(duì)代謝組學(xué)的研究，是將某個(gè)細(xì)胞、組織或器官的代謝物作為集合，然后進(jìn)行整體分析，對(duì)比圖譜信息異同，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)樣品的鑒別或者分類(lèi)。

按照分析流程，將代謝指紋分析過(guò)程分為生物分析和數(shù)據(jù)分析。生物分析就是從樣品中獲得大量原始數(shù)據(jù)（圖譜）的過(guò)程，該過(guò)程可能用到的分析技術(shù)有核磁共振技術(shù)（nuclear magnetic resonance，NMR）、LC—MS以及 GC—MS等；數(shù)據(jù)分析就是通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)（圖譜）的篩選后，比對(duì)圖譜差異，采用PCR或者偏最小二乘法—判別分析（PLS—DA）發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)的變化規(guī)律，進(jìn)而體現(xiàn)代謝的整體過(guò)程（圖2）［9］。

圖2 代謝指紋分析流程圖Figure 2 The flow chart of metabolic fingerprinting

吳海強(qiáng)等［10］通過(guò)對(duì)比鯽魚(yú)（Carassius aumtus）和鰱魚(yú)（Hypophthalmichehys molitrix）兩種魚(yú)的雙向蛋白質(zhì)電泳圖（two－dimensional electrophoresis，2－DE）發(fā)現(xiàn)，2－DE譜圖完全可以鑒定和區(qū)別不同物種的蛋白組分，可作為進(jìn)一步鑒定過(guò)敏原的基礎(chǔ)；周劍忠等［11］通過(guò)PCR—DGGE指紋圖譜技術(shù)結(jié)合16SrDNA序列分析了藏靈菇中微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)藏靈菇中乳酸菌（Lactobacillus）和酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）居多，此外還存在不可培養(yǎng)微生物。

Gall等［12］利用NMR指紋圖譜和多元分析法來(lái)辨別橘汁的摻假，針對(duì)其中6個(gè)主成分的分析構(gòu)建了有效的分類(lèi)模型，可識(shí)別人工和天然橘子汁。Chen等［13］通過(guò)常壓解吸抽樣偶聯(lián)電離子噴霧技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，檢測(cè)了不同樣品中的代謝物（來(lái)自微生物生長(zhǎng)或樣品自身代謝），發(fā)現(xiàn)不同保藏方式的肉類(lèi)和菠菜的指紋圖譜存在明顯的差異，指出肉類(lèi)制品在－20℃下也可被大腸桿菌污染，同時(shí)指出了這種基于代謝物的新型檢測(cè)策略代表了一種“綠色”食品質(zhì)量快速評(píng)價(jià)的方法。

代謝指紋分析可廣泛應(yīng)用于食品的保藏、加工方式以及微生物利弊的鑒定，在食品工藝優(yōu)化、降低生成成本、保證產(chǎn)品的一致性等方面具有潛在的應(yīng)用前景。

1.3 同位素指紋分析技術(shù)

研究［14］發(fā)現(xiàn)同位素的組成變化是極復(fù)雜的，特別受氣候及地形、生物代謝類(lèi)型等影響顯著。目前用于食品溯源追蹤的可標(biāo)記同位素主要有H、C、N、O等。劉衛(wèi)霞等［15］介紹了有機(jī)同位素稀釋質(zhì)譜法在于農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、抗生素、天然毒素等方面的應(yīng)用，明確了同位素稀釋色譜—質(zhì)譜技術(shù)于食品安全的重要性。劉澤鑫等［16］采用同位素比率質(zhì)譜儀（IRMS）檢測(cè)了牛尾毛樣品（陜西關(guān)中不同區(qū)縣）的δ13C和δ15N值，發(fā)現(xiàn)利用同位素之間的差異可實(shí)現(xiàn)牛肉產(chǎn)地小范圍的溯源。Schmidt等［17］通過(guò)穩(wěn)定性同位素C、N、S，分析了美國(guó)的23個(gè)牛肉樣品和歐洲的35個(gè)牛肉樣品，表明2個(gè)地區(qū)的牛肉的δ13C特征明顯不同，可以對(duì)牛肉進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分。生物體中某些同位素信息與生物的生存環(huán)境息息相關(guān)，通過(guò)這一獨(dú)特的特征就可以對(duì)生物的身份信息進(jìn)行獨(dú)立、科學(xué)的鑒定［18］。

1.4 氣味指紋分析技術(shù)

氣味指紋分析技術(shù)是以揮發(fā)性成分為監(jiān)測(cè)對(duì)象，檢測(cè)技術(shù)是最關(guān)鍵的，如GC—MS、氣相色譜—嗅覺(jué)測(cè)定法（gas chromatograph－olfactometry，GC—O）、電子鼻（electronic nose）等技術(shù)。氣味指紋圖譜分析技術(shù)廣泛用于風(fēng)味物質(zhì)類(lèi)別和結(jié)構(gòu)的分析，通過(guò)建立氣味和品質(zhì)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)食品品質(zhì)的預(yù)測(cè)。

Olfa Baccouri等［19］采用 HS—SPME—GC—MS和 GC，對(duì)不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)期和農(nóng)藝條件處理下的橄欖油進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)成熟過(guò)程能夠顯著改變揮發(fā)性成分的種類(lèi)，反映橄欖油的品質(zhì)。Limbo等［20］通過(guò)化學(xué)法和電子鼻氣味識(shí)別技術(shù)對(duì)不同儲(chǔ)藏溫度（－0.5，4.8，16.5℃）下的鱸魚(yú)（Lateolabrax japonicus）貨架期進(jìn)行了評(píng)價(jià)，表明氣味感官技術(shù)對(duì)鱸魚(yú)貨架期預(yù)測(cè)具有可行性。Sarnoski等［21］利用SPME—GC—MS對(duì)作為青蟹（Scylla serrata）腐敗標(biāo)志的揮發(fā)性成分三甲胺和吲哚進(jìn)行了分析，用于水產(chǎn)品的品質(zhì)預(yù)測(cè)。電子鼻技術(shù)就是憑借電化學(xué)傳感器陣列及合適的識(shí)別裝置，實(shí)現(xiàn)通過(guò)儀器“嗅覺(jué)”客觀分析樣品的一種技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于果蔬無(wú)損檢測(cè)、肉禽水產(chǎn)類(lèi)新鮮度及微生物檢測(cè)等方面［22－24］。

1.5 光譜指紋分析技術(shù)

光譜指紋分析技術(shù)的運(yùn)行原理就是通過(guò)那些對(duì)光具有吸收、散射、反射等特性的物質(zhì)對(duì)食品進(jìn)行監(jiān)控，包括品質(zhì)監(jiān)控和安全監(jiān)控，是一種間接測(cè)量的技術(shù)（也稱為軟測(cè)量技術(shù)）。光譜指紋技術(shù)以速度快、可實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)測(cè)量以及樣品不需要復(fù)雜的前處理過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于實(shí)時(shí)在線分析和非侵入、非破壞性檢測(cè)。

林巖等［25］采用近紅外光譜（near infrared，NIR）和聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘方法（SiPLS）的方法，通過(guò)對(duì)比光譜數(shù)據(jù)，指出該結(jié)合技術(shù)可對(duì)豬肉蛋白質(zhì)及脂肪進(jìn)行定量分析。楊永存等［26］通過(guò)采集137份油樣和17份精煉“地溝油”，對(duì)比傅立葉變換中紅外吸收光譜，指出根據(jù)吸收峰及其形狀還不能有效鑒別“地溝油”與食用植物油，因而還有待進(jìn)一步的探索。Quansheng Chen等［27］在食醋總酸含量測(cè)定研究中指出近紅外光譜技術(shù)協(xié)同Si－PLS和曲線回歸工具可作為食醋總酸含量測(cè)定的潛在方法；Del Bove等［28］采用FI—IR結(jié)合軟件分析將意大利的10個(gè)地域奶酪中22種酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）進(jìn)行快速鑒別和表型分類(lèi)。

2 指紋分析技術(shù)在食品中的應(yīng)用研究

2.1 食品溯源追蹤

馬冬紅等［29］采用同位素比率質(zhì)譜儀對(duì)廣東、海南、福建、廣西4地羅非魚(yú)（Oreochromis spp）中的 δ2H 值進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同地域的羅非魚(yú)δ2H值存在明顯差異，表明穩(wěn)定性氫同位素可以很好地反應(yīng)羅非魚(yú)來(lái)源地信息。Zhao等［30］利用近紅外光譜發(fā)現(xiàn)可以有效地對(duì)小麥的來(lái)源、基因型和生長(zhǎng)期進(jìn)行解析。孟一等［31］基于近紅外光譜技術(shù)快速識(shí)別不同動(dòng)物源肉品，建立了豬肉、牛肉和羊肉的定性識(shí)別模型。Yan Zhao等［32］指出了穩(wěn)定性同位素是一種強(qiáng)有力的工具，可以很好地鑒別來(lái)自動(dòng)植物的農(nóng)產(chǎn)品及產(chǎn)地，同時(shí)也指出了使用該技術(shù)時(shí)存在的局限性。Enache等［33］提出了遺傳指紋圖譜技術(shù)可作為動(dòng)物產(chǎn)品溯源的新方法?？梢?jiàn)，伴隨現(xiàn)代指紋技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)建立食品危害物來(lái)源追蹤體系，對(duì)食品安全危害源頭實(shí)現(xiàn)溯源，逐漸會(huì)成為今后研究的熱點(diǎn)。

2.2 食品品質(zhì)檢測(cè)

食品摻假、食品貨架期、食品有毒有害物質(zhì)檢測(cè)等，是食品品質(zhì)方面的重要問(wèn)題。吳衛(wèi)國(guó)等［34］建立了5類(lèi)食用植物油標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)這些圖譜不僅能夠反映同類(lèi)油脂共同特性，同時(shí)也能反映不同類(lèi)油脂之間的差異，這就為食用植物油脂的產(chǎn)品質(zhì)量控制和摻假檢測(cè)提供了理論依據(jù)。解萬(wàn)翠等［35］利用電子鼻技術(shù)（electronic nose）檢測(cè)蝦風(fēng)味料中香氣成分，發(fā)現(xiàn)電子鼻對(duì)兩種蝦風(fēng)味料的風(fēng)味輪廓有較強(qiáng)的識(shí)別能力。王琴等［36］采用反相高效液相色譜（RP—HPLC）結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD），分別檢測(cè)摻入代可可脂和棕櫚油的可可粉摻假樣品，通過(guò)脂質(zhì)指紋分析發(fā)現(xiàn)該方法可以鑒別摻入1.2%及以上的摻假樣品。Lin等［37］通過(guò)將近紅外光譜、電腦成像和電子鼻技術(shù)連用的方式，對(duì)90多種不同新鮮度的豬肉進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)連用技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)揮發(fā)性鹽基氮的無(wú)損檢測(cè)。田曉靜［38］應(yīng)用電子鼻電子舌技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)凍融不同次數(shù)的羊肉的檢測(cè)，同時(shí)建立了能夠識(shí)別豬肉、雞肉等摻入到羊肉中的預(yù)測(cè)辨假模型。王秋艷等［39］對(duì)比了ERIS—PCR、PFGE和Sau—PCR 3種方法對(duì)5株福氏志賀菌進(jìn)行溯源性分析，分別指出了3種方法在這方面應(yīng)用的優(yōu)缺點(diǎn)，且3種方法均能達(dá)到檢測(cè)5株菌的目的。Covadonga等［40］采用傳統(tǒng)法和微波加熱對(duì)橄欖油進(jìn)行熱降解，通過(guò)利用31P的NMR光譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)加熱法對(duì)油的損傷大于微波加熱。

2.3 食品加工過(guò)程中化學(xué)和微生物的變化

食品的腐敗劣化，其原因來(lái)自很多方面，如酶的分解、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的氧化以及微生物的生長(zhǎng)活動(dòng)等，特別是微生物的活動(dòng)是食品劣變的主要因素。食品指紋分析技術(shù)在微生物的鑒別、菌落動(dòng)態(tài)監(jiān)控等方面可以發(fā)揮作用。石磊等［41］利用組織平板培養(yǎng)法及ERIC—PCR法定量分析了48株P(guān)A生物被膜的形成，通過(guò)指紋圖譜分析指出菌株生物被膜形成能力和基因型二者之間具有一定的相關(guān)性。Zheng等［42］通過(guò)結(jié)合DGGE和磷脂脂肪酸來(lái)鑒定不同發(fā)酵階段濃香型酒的微生物菌落形態(tài)特征，指出了窖泥中的主要菌體。Nol等［43］指出了PCR—DGGE技術(shù)可以快速監(jiān)測(cè)咖啡加工中的微生物，特別是對(duì)赭曲霉素（ochratoxin）的形成的研究。Sahar等［44］發(fā)現(xiàn)利用傅立葉變換紅外光譜儀可以預(yù)測(cè)貯藏雞胸肉魚(yú)片的腐敗菌數(shù)量。

3 展望

指紋技術(shù)在貨架期預(yù)測(cè)方面應(yīng)用仍處試驗(yàn)階段。氣味作為食品品質(zhì)優(yōu)劣判斷的一項(xiàng)重要指標(biāo)，常規(guī)方法就是進(jìn)行感官評(píng)價(jià)及經(jīng)驗(yàn)評(píng)估，因而會(huì)引入極大的不確定性。因此可針對(duì)各技術(shù)的優(yōu)劣勢(shì)，通過(guò)多技術(shù)的相互組合，將指紋技術(shù)作為一個(gè)多元的、不設(shè)基點(diǎn)的技術(shù)來(lái)篩選關(guān)鍵質(zhì)量的差異，從而進(jìn)行分析判定。未來(lái)可將生物技術(shù)與現(xiàn)代檢測(cè)手段的食品指紋圖譜分析技術(shù)相結(jié)合，使其在食品從農(nóng)田（養(yǎng)殖場(chǎng)）到餐桌的體系中發(fā)揮作用，實(shí)施監(jiān)控，促進(jìn)食品產(chǎn)業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化，推動(dòng)行業(yè)的快速發(fā)展。

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