超聲波輔助提取五倍子中單寧的工藝優(yōu)化

李倩云 張雙靈 周國燕

（1.上海理工大學，上海 200093；2.青島農(nóng)業(yè)大學，山東 青島 266109）

五倍子主要分布于中國的四川、湖南、湖北等地，是一種重要的經(jīng)濟中藥材，可緩解肺熱引發(fā)的咳嗽、常泄不止、痢疾不愈等［1］。單寧具有純天然、效率高、安全無毒性、保護健康等優(yōu)點，其利用價值很高，發(fā)展前景極其廣闊。目前，測定五倍子中單寧的方法主要有紫外分光光度法、藥典法（皮粉法）、HPLC法（高效液相色譜法）等［2］。藥典法是各國同行認可的單寧酸測定方法，雖然其提取的試驗結果較為穩(wěn)定，但是所用的時間很長，過程復雜，不適合微量和低含量測定［3］。高效液相色譜法法操作簡單迅速，具有較高的靈敏度，但需要較高的分析技能和高純度的標準品，檢測成本高［4］。在眾多單寧含量的測定方法中，紫外分光光度法的應用最為廣泛，具有簡單、迅速等優(yōu)點［5］，因此本試驗采用此法進行測定。

超聲波輔助提取方法具有操作簡單快速、提取率高、花費少、安全等優(yōu)勢［6］，已廣泛用在提取多種自然物質(zhì)的研究中，如：超聲波輔助提取鎖陽多糖的工藝研究［7］，超聲輔助法提取桑葚葉中的多糖［8］，超聲波輔助提取酵母源類金屬硫蛋白工藝的優(yōu)化［9］，超聲波輔助提取山豆根中的黃酮和多糖工藝優(yōu)化［10］，超聲復合酶法提取大蒜多糖的工藝優(yōu)化［11］。從五倍子中提取單寧的工藝研究［12，13］較多，但報道的結果不盡相同。目前沒有對鹽酸體積分數(shù)、乙醇體積分數(shù)、超聲溫度及料液比4種因素同時進行研究的報道，本試驗擬采用超聲波輔助提取技術從五倍子中提取單寧，探究鹽酸體積分數(shù)、乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、料液比4個因素對超聲輔助法提取五倍子單寧提取效率的影響，并利用正交試驗優(yōu)化工藝條件，從而為五倍子開發(fā)的工業(yè)化提供理論依據(jù)，為進一步研究單寧的生物活性提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

五倍子：肚倍，產(chǎn)于四川省德陽市，市售；

無水乙醇、單寧標準品、香草醛固體、甲醇、濃鹽酸：均為市售分析純。

1.2 主要儀器與設備

紫外分光光度計：754型，上海光譜儀器有限公司；

電子天平：AR224CN型，上海奧豪斯儀器有限公司；

超聲波清洗器：KQ-500E型，昆山市超聲儀器有限公司；

九陽粉碎機：JYL-0012型，上海高橋粉碎機廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理 首先挑選出飽滿干凈的五倍子，將五倍子破殼，去蟲尸，取一定量的五倍子碎片粉碎，得五倍子粉末，將其放于棕色瓶中，干燥、避光保存，備用。

1.3.2 單寧的提取 分別稱取多份1.0g的五倍子粉末，根據(jù)不同的料液比，用乙醇溶液溶解，輔助加入鹽酸溶液，將其放在超聲波清洗機內(nèi)浸提，持續(xù)120s，完成后進行過濾，濾液轉(zhuǎn)移到25mL的容量瓶中，加乙醇溶液到刻度線，搖晃均勻。準確移取2.50mL于具塞試管中，加入4%的香草醛溶液3.00mL，慢慢滴加1.50mL的濃鹽酸，在無光常溫條件下靜放25min，于505nm處測量不同溶液的吸光度值，同時以空白試劑作參比。

1.3.3 單寧標準曲線的繪制 根據(jù)文獻［14］，精密稱量0.5 g單寧，用甲醇溶解并定容到50mL的容量瓶中，得到濃度為0.01g/mL的單寧標準溶液。依次量取0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00mL的單寧標準溶液放在6個25mL的容量瓶內(nèi)，加甲醇溶液到刻度線，搖晃均勻。依次精密吸取以上各單寧溶液2.50mL放在6只具塞試管中，各加3.00mL的4%的香草醛溶液，慢慢滴入濃鹽酸1.50mL，在無光常溫下靜放25min，于505nm處測吸光值，以空白試劑作為參比。縱軸是測得的各溶液的吸光度值，橫軸是不同的單寧濃度，制作單寧的標準曲線。

1.3.4 單因素試驗設計

（1）鹽酸體積分數(shù)對五倍子單寧提取率的影響：稱取1.0g五倍子粉末，加入70%的乙醇溶液，超聲溫度為50℃，料液比為1∶30（m∶V），鹽酸體積分數(shù)分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，研究鹽酸體積分數(shù)對五倍子單寧提取率的影響。

（2）乙醇體積分數(shù)對五倍子單寧提取率的影響：稱量1.0g五倍子粉末，超聲溫度為50℃，料液比為1∶30（m∶V），鹽酸體積分數(shù)為1.0%，乙醇體積分數(shù)分別為30%，40%，50%，60%，70%，研究乙醇體積分數(shù)對五倍子單寧提取率的影響。

（3）超聲溫度對五倍子單寧提取率的影響：稱取1.0g五倍子粉末，鹽酸體積分數(shù)為1.0%，70%的乙醇溶液，料液比為1∶30（m∶V），超聲溫度分別為40，50，60，70，80℃，研究超聲溫度對五倍子單寧提取率的影響。

（4）料液比對五倍子單寧提取率的影響：稱取1.0g五倍子粉末，以70%的乙醇溶液為提取溶劑，鹽酸體積分數(shù)為1.0%，提取溫度為50℃，料液比分別為1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（m∶V），考察料液比對五倍子單寧提取率的影響。

1.3.5 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，選用L9（34）進行正交試驗設計，每個試驗重復3次。

1.4 五倍子單寧提取率測定

以五倍子為樣品，用乙醇溶解，按照1.3.2方法在505nm波長下測吸光度。對照標準曲線，由回歸方程可得單寧濃度。按式（1）求出五倍子單寧的提取率。

式中：

R——單寧提取率，%；

C——由標準曲線求得的單寧濃度，mg/mL；

V1——稀釋體積，mL；

V2——樣品溶液的體積，mL；

M——樣品質(zhì)量，g；

V3——吸取樣品溶液的體積，mL。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

利用Spss17.0版軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 單寧的標準曲線 由單寧濃度（Cmg/mL）和吸光度值（A），得到單寧的標準曲線（見圖1），擬合得到：A＝0.145 8C＋0.084 5，R2＝0.999 0，表明單寧質(zhì)量濃度在1.0～4.0 mg/mL時具有良好的線性關系。

圖1 不同濃度單寧吸光度值的標準曲線Figure 1 Standard curves of different concentration of tannin absorbance value

圖2 鹽酸體積分數(shù)對五倍子單寧提取率的影響Figure 2 Effects of volume fraction of HCl on the extraction rate of Gallic tannins

2.1.2 鹽酸體積分數(shù)對五倍子單寧提取率的影響 由圖2可知，鹽酸體積分數(shù)對單寧的提取率有極顯著影響（P＜0.01）。當體積分數(shù)為0.5%～1.0%時，單寧的提取率隨著鹽酸體積分數(shù)的增大而升高；但高于1.0%時，提取率不再呈上升趨勢。說明鹽酸的體積分數(shù)影響單寧的提取率，下降是由于乙醇—水體系不但能斷裂單寧與金屬離子的絡合鍵，而且還能幫助斷裂單寧和蛋白質(zhì)、多糖以及其自身之間的疏水鍵和氫鍵。因此較優(yōu)的鹽酸體積分數(shù)為0.5%～1.5%。

2.1.3 乙醇體積分數(shù)對五倍子單寧提取率的影響 由圖3可知，乙醇體積分數(shù)對單寧的提取率有顯著影響（P＜0.05）。在乙醇體積分數(shù)為40%～50%時，單寧的提取率因乙醇的濃度變大而提高；高于50%時，提取率降低。原因是當乙醇體積分數(shù)增大時，乙醇溶液能夠溶解的單寧的量也隨之增大；下降可能是由于五倍子中某些物質(zhì)釋放出來抑制了單寧的溶解，所以較優(yōu)的乙醇體積分數(shù)為40%～60%。

圖3 乙醇體積分數(shù)對五倍子單寧提取率的影響Figure 3 Effects of volume fraction of ethanol on the extraction rate of Gallic tannins

圖4 超聲溫度對五倍子單寧提取率的影響Figure 4 Effects of Ultrasonic temperature on the extraction rate of Gallic tannins

2.1.4 超聲溫度對五倍子單寧提取率的影響 由圖4可知，超聲溫度對單寧的提取率有極顯著影響（P＜0.01）。當超聲波溫度在40～50℃時，單寧的提取率會因溫度的提高而增大；高于50℃時提取率不斷降低。原因是當溫度上升時，單寧等酚類物質(zhì)活性提高，于溶劑里面的溶解度也會升高；下降是因為單寧的結構不夠牢固，當處于較高的溫度時會分解，或者容易被氧化；也可能是因為溫度太高，導致細胞內(nèi)的膠體等析出物數(shù)量上升，使溶液的粘稠度提高，阻礙了單寧的溶出。因此較優(yōu)的超聲溫度為40～60℃。

2.1.5 料液比對五倍子單寧提取率的影響 由圖5可知，料液比對單寧的提取率有顯著影響（P＜0.05）。當料液比在1∶20～1∶30（m∶V）時，料液比漸漸升高，提取率亦會升高；大于1∶30（m∶V）時，提取率下降。原因可能是溶劑體積增多，與五倍子接觸面積增大，使其中的單寧能與溶劑充分接觸，從而提取率增大；下降是因為當料液比升高時，溶劑增多，單位體積內(nèi)的單寧濃度會下降，易引發(fā)氧化作用。因此當不斷提升料液比時，單寧的提取率會降低。因此較優(yōu)的料液比為1∶25～1∶35（m∶V）。

圖5 料液比對五倍子單寧提取率的影響Figure 5 Effects of Ratio of material to liquid on the extraction rate of Gallic tannins

2.2 正交試驗結果

2.2.1 正交試驗及結果分析 在單因素試驗的基礎上，選取鹽酸濃度、乙醇濃度、超聲溫度、液料比4個因素設計正交試驗。正交試驗因素水平設計見表1，試驗組合及結果見表2。

由表2中的極差分析能夠得出，對五倍子單寧提取率影響由大到小的因素是：料液比＞超聲溫度＞乙醇體積分數(shù)＞鹽酸體積分數(shù)，由K值大小可以選出最優(yōu)水平組合為A2B2C1D2，即1.0%的鹽酸溶液、50%的乙醇溶液、超聲波溫度為40℃、料液比1∶30（m∶V）。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Single factor selection table

表2 正交試驗結果及極差分析Table 2 The results of orthogonal test and range

2.2.2 方差分析 由表3可知，當顯著水平在0.05時，乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、料液比對單寧提取率影響結果具有顯著性 （P＜0.05）。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.2.3 驗證實驗 按照最佳方案A2B2C1D2進行驗證實驗，平行做3次，取平均值，測得五倍子中單寧的平均提取率為10.97%。該結果大于正交試驗表中的最大值，因此A2B2C1D2為本試驗的最優(yōu)組合。

3 結論

本試驗以單因素試驗為基礎，采用正交試驗優(yōu)化超聲輔助提取五倍子單寧的工藝條件。研究表明鹽酸體積分數(shù)、乙醇體積分數(shù)、超聲溫度可以顯著影響五倍子單寧的提取效率，得到超聲波輔助法提取五倍子中單寧最優(yōu)工藝條件是：鹽酸體積分數(shù)為1.0%、乙醇體積分數(shù)為50%、超聲溫度為40℃、料液比為1∶30（m∶V）。在此條件下，單寧的最大提取率為10.97%，提取率比文獻［15］報道的7.32%明顯提高。本研究得到的工藝條件可為工業(yè)提取單寧提供參考，為五倍子中單寧的進一步開發(fā)利用提供幫助。

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