黃海海燕體壁酶解物抗氧化活性研究

李裕博 紀曉琳 劉 山 查 越 辛丘巖 啟 航

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

黃海海燕（Asterinapectinifera）俗稱海星，屬海星綱有棘目海燕科，常見于中國黃海、渤海一帶，是分布廣泛的海洋生物資源之一［1］，主要以扇貝、鮑魚、海膽等海珍品為食，對沿海的水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大的危害。黃海海燕除含有蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、微量元素和維生素等外，還含有大量結(jié)構(gòu)獨特且具有生物活性的代謝產(chǎn)物，具有良好的生理活性和藥理活性［2］。由于海洋動物的生長環(huán)境特殊，其在生理和藥理方面具有陸地生物所沒有的活性物質(zhì)如海燕皂苷、海參皂苷、蝦青素、深海魚油、鱟素，在抗氧化活性的研究方面具有潛在價值。到目前為止，具有抗氧化活性的酶解物已經(jīng)從許多類型的海洋生物中提取出來，例如魚類［3］、魷魚［4］、蝦類［5］、棘皮動物［6］和雙殼類軟體動物［7］。

劉小玲等［8］利用蛋白酶對羅非魚魚皮進行酶解，經(jīng)試驗表明，魚皮膠原肽對羥基具有一定的清除能力，且隨著膠原肽濃度的增加而增大。王蒞莎等［9］經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾柱從雌、雄鮑魚臟器粗多糖中各分離出兩種多糖組分，經(jīng)測定其清除羥基自由基的IC50分別為1.38，0.99，1.51，1.19mg/mL。任俊鳳等［10］通過木瓜蛋白酶酶解河豚魚皮提取膠原蛋白肽，并對其抗氧化活性進行了研究，確定蛋白肽具有清除自由基的能力。盤賽昆等［11］通過對鳙魚肉進行酶解制備抗氧化活性肽，結(jié)果表明，酶解物對羥基自由基的最高清除率可達到91.2%。張爽等［12］對鮑魚外套膜酶解物進行了抗氧化活性的研究，測定酶解物清除DPPH自由基和羥基自由基的IC50分別為11.76，12.07mg/mL。周大勇等［13］利用胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶對鮑魚內(nèi)臟進行酶解，測得3種酶解物對DPPH自由基清除率的IC50值均為4 mg/mL，對羥基自由基清除率的IC50值分別為8，4，5mg/mL。顧明廣等［14］對魚皮膠原蛋白進行酶解制備抗氧化肽，抗氧化活性試驗結(jié)果表明，小分子量膠原蛋白清除DPPH自由基的能力由原膠原蛋白的26%提高到74%。

電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）又稱電子順磁共振，是在磁場中測量臨界狀態(tài)下未成對的電子的理論基礎(chǔ)上發(fā)展而來［15］，可以探測和識別具有未成對電子的分子，是檢測自由基最直接最有效的方法［16］。氧自由基容易引起細胞損傷，導(dǎo)致疾病發(fā)生，對機體危害極大。本試驗主要以黃海海燕體壁為原料制備酶解物，應(yīng)用ESR技術(shù)檢測粗酶解物對DPPH自由基和羥基自由基的清除作用，對不同酶種所得酶解物的清除效果進行了對比，以期為黃海海燕體壁酶解產(chǎn)物在保健食品開發(fā)相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

黃海海燕（Asterinapectinifera）：大連太平洋海珍品有限公司；

胃蛋白酶：13 274U/g，上海生工生物股份有限公司；

胰蛋白酶：103 405U/g，上海生工生物股份有限公司；

中性蛋白酶：75 000U/g，南寧龐博生物工程有限公司；

DPPH：美國sigma-aldrich公司；

DMPO：優(yōu)級純，上海阿拉丁試劑有限公司；

其余試劑：均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

冷凍離心機：RC-6plus型，美國Virtis公司；

真空冷凍干燥機：ZKBTES-55型，美國Virtis公司；

干燥箱：PH070A型，上海一恒科技有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，予華儀器有限公司；

酶標儀：infiniteM200型，瑞士TECAN公司；

pH計：PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

電子順磁共振波譜儀：A200型，德國Bruker Opertics公司。

1.2 方法

1.2.1 黃海海燕的預(yù)處理 新鮮黃海海燕，去除內(nèi)臟，自來水清洗干凈后，于干燥箱中烘干。用1mol/L HCl浸泡，每6 h更換一次HCl，直至不再產(chǎn)生氣泡，用去離子水洗至中性，在干燥箱（80℃）中干燥24h后粉碎備用。

1.2.2 酶解液的制備 將8g粉碎后的黃海海燕體壁粉與100mL水混合，分別在胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶的最適條件下（胃蛋白酶37℃，pH 2.0；中性蛋白酶45℃，pH 7.0；胰蛋白酶37℃，pH 8.0）按照2 500U/g·底物加入酶，酶解3h，酶解結(jié)束后置于沸水浴中滅酶10min，4 000r/min離心20min，取上清冷凍干燥后將3種酶的酶解物按照濃度為10，20，30，40，50mg/mL的梯度配成酶解液，置于－80℃冰箱中保存，備用。

1.2.3 肽得率的測定 將經(jīng)過酶解的粗酶解液與10%TCA按照1∶1的比例混合均勻，靜置30min后，采用福林酚法測定肽得率［17］。

1.2.4 酶解液清除DPPH自由基活性測定 200μmol/L的DPPH溶液和不同濃度的粗酶解液混合，避光保存30 min，立即吸入毛細管，放入諧振腔，在中心磁場強度3 368.6 G；微波功率5.32mW；微波頻率9.44GHz；放大倍數(shù)1.42×104；調(diào)制幅度1.0G；調(diào)制頻率100kHz；時間常數(shù)81.92 ms；轉(zhuǎn)換時間40ms條件下掃描。空白組中粗酶解液用去離子水代替。以波譜信號第3個峰高值表示信號的相對強度，按式（1）計算清除率：

1.2.5 酶解液清除羥基自由基活性測定 將不同濃度的粗酶解液與羥基自由基體系混合，40℃水浴30min，立即吸入毛細管，放入諧振腔，在中心磁場強度3 369.08G；微波功率74.8mW；微波頻率9.44GHz；放大倍數(shù)1.00×105；調(diào)制幅度1.0G；調(diào)制頻率100kHz；時間常數(shù)163.84ms；轉(zhuǎn)換時間160ms條件下掃描，空白組中粗酶解液用去離子水代替，以波譜信號第2個峰高值表示信號的相對強度，按式（1）計算清除率：

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 試驗中做3組平行，數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差的方式表示，利用SPSS對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用單向方差分析，P＜0.05被認為是顯著的。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃海海燕體壁酶解物肽得率

由圖1可知，在中性蛋白酶和胰蛋白酶二者之間沒有顯著性差異，胃蛋白酶與其他兩種酶存在顯著性差異。此結(jié)果中胃蛋白酶組數(shù)據(jù)與黃鵬等［18］用胃蛋白酶酶解沙棘粕制備生物活性肽報道的肽得率4.58%大致相近；但與趙鴻霞等［19］報道用中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解海參卵所得肽得率50.49%和30.51%的相比較低。

圖1 3種蛋白酶對黃海海燕體壁進行酶解的肽得率Figure 1 The rate of peptide from the body wall of starfish Asterina pectinifera using the three proteases

2.2 酶解液對DPPH自由基的清除作用

本試驗采用電子自旋共振（ESR）技術(shù)分別檢測不同濃度的黃海海燕體壁酶解液對DPPH自由基的清除效果，3種酶解液（胃蛋白酶組、中性蛋白酶組和胰蛋白酶組）對DPPH自由基都具有一定的清除效果（圖2），而且清除效果隨著酶解液濃度的升高而增強（圖3）。胃蛋白酶組、中性蛋白酶組和胰蛋白酶組對DPPH自由基清除能力的IC50值分別為19.68，17.71，21.23mg/mL，對于較高濃度的黃海海燕體壁酶解液，中性蛋白酶的酶解液均具有較強的清除能力（P＜0.05）。趙雅娉等［20］利用胃蛋白酶對黃海海燕體壁進行酶解制備膠原蛋白肽并對其抗氧化活性進行了研究，結(jié)果證明，酶解物濃度為20mg/mL時胃蛋白酶酶解物對DPPH自由基的清除率為52%，這與本試驗中IC50值相近。

圖2 3種蛋白酶酶解物對DPPH自由基的清除率Figure 2 The determination of scavenging rate of the three kinds of hydrolysate on DPPH radical

圖3 酶解物對DPPH自由基清除作用的ESR圖譜Figure 3 ESR spectrum of effects of hydrolysate on DPPH radical scavenging

2.3 酶解液對羥基自由基的清除作用

本試驗采用電子自旋共振（ESR）技術(shù)檢測黃海海燕體壁對粗酶解液對羥基自由基的清除效果，3種酶解液（胃蛋白酶組、中性蛋白酶組和胰蛋白酶組）對羥基自由基都具有一定的清除效果，如圖4所示，而且清除效果隨著酶解液濃度的升高而增強（清除率由ESR峰值計算，如圖5所示），胃蛋白酶組、中性蛋白酶組和胰蛋白酶組對羥基自由基的清除能力的IC50值分別為15.17，11.94，16.65mg/mL。胃蛋白酶和中性蛋白酶酶解物對羥基自由基清除率沒有顯著差別（P＜0.05），但是在10mg/mL和20mg/mL條件下，中性蛋白酶組對羥基自由基具有顯著較高的清除率。

圖4 3種蛋白酶酶解物對羥基自由基的清除率Figure 4 The determination of scavenging rate of the three kinds of hydrolysate on hydroxyl radical

圖5 酶解物對羥基自由基清除作用的ESR圖譜Figure 5 ESR spectrum of effects of hydrolysate on hydroxyl radical scavenging

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，由胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解黃海海燕體壁所得到的酶解物對DPPH自由基和羥基自由基都具有很好的清除作用，可以作為抗氧化清除自由基的良好原料。并且中性蛋白酶酶解物對DPPH自由基和羥基自由基具有明顯的清除能力，其對DPPH自由基和羥基自由基清除能力的IC50值分別為17.71，11.94mg/mL。黃海海燕體壁酶解液為開發(fā)新型功能性海洋食品基料提供了一定的理論依據(jù)，將提高黃海海燕的利用價值，并將擴展ESR技術(shù)在水產(chǎn)品加工與檢測方面的應(yīng)用。

1 郭承華，張芳，劉迅，等.黃海產(chǎn)海燕黃海海燕皂甙的制備［J］.海洋通報，2000，19（2）：93.

2 汪行舟，安立龍.海星資源的開發(fā)現(xiàn)狀及發(fā)展［J］.資源開發(fā)與利用，2007，24（3）：31～34.

3 Je J Y，Lee K H，Lee M H，et al.Antioxidant and antihypertensive protein hydrolysates produced from tuna liver by enzymatic hydrolysis［J］.Food Research International，2009，42（9）：1 266～1 272.

4 Lin Lin，Li Ba-fang.Radical scavenging properties of protein hydrolysates from Jumbo flying squid（Dosidicus eschrichitii Steenstrup）skin gelatin［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2006，86（14）：2 290～2 295.

5 Guerard F，Sumaya-Martinez M T，Laroque D，et al.Optimization of free radical scavenging activity by response surface methodology in the hydrolysis of shrimp processing discards［J］.Process Biochemistry，2007，42（11）：1 486～1 491.

6 Mamelona J，Saint-Louis R，Pelletieré.Nutritional composition and antioxidant properties of protein hydrolysates prepared from echinoderm byproducts［J］.International Journal of Food Science＆Technology，2010，45（1）：147～154.

7 Dong Xiu-ping，Zhu Bei-wei，Zhao Hong-xia，et al.Preparation and in vitro antioxidant activity of enzymatic hydrolysates from oyster （Crassostrea talienwhannensis）meat［J］.International Journal of Food Science ＆ Technology，2010，45（5）：978～984.

8 劉小玲，林瑩，尹秀華，等.羅非魚皮膠原肽的制備及抗氧化活性研究［J］.食品與機械，2007，23（3）：92～95.

9 王蒞莎，朱蓓薇，周大勇，等.鮑魚臟器多糖的抗氧化活性研究［J］.食品與機械，2008，24（4）：65～69.

10 任俊鳳，任婷婷，朱蓓薇.河豚魚皮膠原蛋白肽的提取及其抗氧化活性的研究［J］.中國食品學(xué)報，2009，9（1）：77～83.

11 盤賽昆，顧小紅，湯堅，等.鳙魚肉酶解物清除羥基自由基的研究［J］.食品與機械，2008，25（4）：64～67.

12 張爽，朱蓓薇，董秀萍，等.不同分子質(zhì)量鮑魚外套膜酶解物抗氧化活性研究［J］.食品與機械，2012，28（3）：108～111.

13 Zhou Da-yong，Zhu Bei-Wei，Qiao Lu，et al.In vitro antioxidant activity of enzymatic hydrolysates prepared from abalone viscera［J］.Food ＆ Bioproducts Processing：Transactions of the Institution of Chemical Engineers Part C，2012，90（2）：148～154.

14 顧明廣，蘇芳，劉艷霞.酶解魚皮膠原蛋白制備抗氧化肽工藝研究［J］.食品與機械，2014，30（2）：149～151.

15 趙保路.電子自旋共振技術(shù)在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［M］.合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，2009：58～59.

16 Falch E，Velasco J，Aursand M，et al.Detection of radical development by ESR spectroscopy techniques for assessment of oxidative susceptibility of fish oils［J］.European Food Research and Technology，2005，221（5）：667～674.

17 杜明，朱蓓薇，云霞，等.酶法水解松仁蛋白的最佳條件研究［J］.食品工業(yè)科技，2003（6）：36～38.

18 黃鵬，蘇寧，王昌濤.沙棘生物活性肽的制備及功效研究［J］.食品與機械，2010，26（6）：67～69.

19 趙鴻霞，周大勇，秦磊，等.響應(yīng)面法優(yōu)化海參卵酶解工藝［J］.食品與機械，2010，26（5）：114～117.

20 趙雅聘，劉山，趙鑫.黃海海燕體壁膠原蛋白肽的制備及其抗氧化活性［J］.食品研究與開發(fā)，2014，35（1）：5～8.