ELISA試劑盒法與GC—MS法檢測紅酒中塑化劑的比較研究

曹必溥 曹 庸 苗建銀 曹素芳 劉 果 譚榮威

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

據(jù)法國國際葡萄酒與烈酒展覽會公布的一項(xiàng)最新研究［1］，中國已超過法國和意大利，成為全球最大的紅酒消費(fèi)國。近年來酒類中塑化劑超標(biāo)的問題引起了人們強(qiáng)烈關(guān)注，然而關(guān)于紅酒中塑化劑檢測的研究未見于報道。塑化劑又稱增塑劑，是一種增加材料的柔軟性或使材料液化的添加劑，其本質(zhì)是一類鄰苯二甲酸酯類化合物，主要是用于塑料制品中，增加塑料的彈性。研究［2－4］顯示，塑化劑為激素類環(huán)境污染物，對人體和動物均有一定的危害，可致癌、致畸及免疫抑制。

目前常用的塑化劑檢測方法有：氣相色譜［5－7］（GC）、高效液相色譜法［8，9］（HPLC）、氣質(zhì)聯(lián)用法［10－13］（GC—MS）、液質(zhì)聯(lián)用法［14－16］（HPLC—MS）。然而在塑化劑檢測中，不同試驗(yàn)樣品的檢測前處理具有較大差異，且可能對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。相比上述常用的檢測方法，ELISA試劑盒法是一種新型的檢測方法。ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)，以及酶的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)，但這種新型的塑化劑檢測方法目前還沒有廣泛使用，其檢測準(zhǔn)確性有待驗(yàn)證和分析。本研究擬分別采用經(jīng)典的檢測塑化劑法——GC—MS法，與新型的快速檢測方法——ELISA試劑盒法，對比分析紅酒中的塑化劑含量，同時對GC—MS法樣品檢測前處理進(jìn)行了改進(jìn)，并以GC—MS法為標(biāo)準(zhǔn)來檢驗(yàn)ELISA試劑盒法的檢測效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅酒：某3種品牌，市售；

鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）ELISA檢測試劑盒：北京普贊生物技術(shù)有限公司；

SPE固相萃取小柱：迪馬科技有限公司。

16種鄰苯二甲酸酯類的混合標(biāo)準(zhǔn)品（文中所指的混標(biāo)如無其他說明，均指此標(biāo)準(zhǔn)品）：鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（DMEP）、鄰苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基）酯（BMPP）、鄰苯二甲酸二（2-乙氧基）乙酯（DEEP）、鄰苯二甲酸二戊酯（DPP）、鄰苯二甲酸二己酯（DHXP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）、鄰苯二甲酸二（2-丁氧基）乙酯（DBEP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（DCHP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二苯酯（DR）、鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP）、鄰苯二甲酸二壬酯（DNP）：迪馬科技有限公司；

丙酮、正己烷、甲醇、甲基叔丁基醚：色譜級，迪馬科技有限公司；

試驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

GC—MS：7890A-5975C型，安捷倫有限公司；酶標(biāo)儀：EnSpire 2300型，鉑金埃爾默儀器有限公司；純水系統(tǒng)：POSEIDON-R70型，廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司；旋渦振蕩器：XW-80A型，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；低速離心機(jī)：DL-5-B型，中國上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 GC—MS法檢測紅酒中塑化劑

（1）樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確量取5mL樣品置于具塞玻璃管中，加入10mL體積比為1︰1的正己烷和甲基叔丁基醚混合液（簡稱混合萃取液），充分渦旋混合4min，4 000r/min離心20min，取上清液，再用10mL混合液萃取液重復(fù)提取2次，合并3次上清液，于40℃水浴中氮吹至近干，用正己烷定容至2mL，待凈化。

（2）預(yù)處理樣品凈化：① 活化：向SPE小柱中加入1.0g無水硫酸鈉，再依次加入丙酮5mL、正己烷5mL，棄去流出液；② 上樣：加入待凈化液，流速控制在1mL/min內(nèi)，收集流出液；③ 洗脫：依次加入正己烷5mL、4%丙酮—正己烷溶液5mL，接收流出液，合并上樣、洗脫流出液；④ 重新溶解：40℃緩慢氮?dú)饬鳁l件下吹至近干，用正己烷定容至1 mL，供GC—MS檢測。

（3）GC—MS檢測條件：色譜柱：DB-5石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：280℃；升溫程序：初始溫度80℃，保持1min，以20℃/min升溫至220℃，保持1min，5℃/min升溫至300℃，保持20min；載氣：氦氣，流速：1mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1μL；色譜與質(zhì)譜接口溫度：280℃；EI離子源，70eV；檢測器溫度：280℃；監(jiān)測方式：選擇離子掃描模式（SIM）；溶劑延遲：5min。

（4）GC—MS法檢測塑化劑加標(biāo)回收率分析：取1mL 1 mg/kg的混標(biāo)添加到5mL紅酒中即得加標(biāo)量為1mg/kg的加標(biāo)組，將加標(biāo)組置于具塞玻璃管中，加入10mL混合萃取液，后續(xù)步驟同1.3.1（1）。加標(biāo)組做2個平行試驗(yàn)。

（5）樣品的檢測：使用GC—MS對處理好的樣品進(jìn)行檢測，每一個樣品做2個平行試驗(yàn)。

1.3.2 ELISA試劑盒法檢測紅酒中塑化劑 由于目前市售的塑化劑ELISA試劑盒都只能檢測單一的塑化劑，故在本研究中僅選擇了鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）ELISA試劑盒作為試驗(yàn)材料。其中洗滌工作液是用去離子水將試劑盒自帶的濃縮洗滌液（10倍）按1∶9體積比進(jìn)行稀釋來配制的，樣品稀釋液是用去離子水將色譜純甲醇按35∶65體積比進(jìn)行稀釋來配制的。

（1）檢測前處理：在干凈的玻璃試管中加入樣品5mL，加入色譜純的正己烷4mL，蓋上，振蕩3min，4 000r/min離心20min，取上清液1mL，于40℃水浴中氮吹至近干。吹干后用1mL 35%的甲醇重溶，轉(zhuǎn)移至2mL裝樣瓶待測。

（2）樣品的檢測：將所需試劑從冰箱中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30min以上，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板。將不同樣本對應(yīng)的微孔按序編號，每個樣本做2孔平行，并記錄樣本孔所在的位置。加樣品50μL到對應(yīng)的微孔中，加入DBP抗試劑50μL/孔，再加入DBP酶標(biāo)物50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)40min。小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液300μL/孔，充分洗滌5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。加入顯色液100μL/孔，用蓋板膜蓋板后置37℃恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)10min。加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：使用試劑盒自帶的DBP標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.00，0.09，0.27，0.81，2.43，7.29mg/kg，具體操作見上述操作步驟。繪制標(biāo)曲時采用雙對數(shù)模型進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。使用試劑盒自帶的DBP標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以B的自然對數(shù)ln（B）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)際濃度C（mg/kg）的自然對數(shù)ln（C）為橫坐標(biāo)。吸光度比值按式（1）計算：

式中：

B——吸光度比值；

A——標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液在450nm波長處的平均吸光度值；

A0——0mg/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液在450nm波長處的平均吸光度值。

1.3.3 GC—MS法和ELISA試劑盒法的比較分析

（1）兩種不同前處理方法的比較分析：使用氣質(zhì)聯(lián)用儀分別對GC—MS法前處理的樣品和ELISA試劑盒法前處理的樣品進(jìn)行檢測。每一種前處理方法做2次平行試驗(yàn)。

（2）GC—MS法和ELISA試劑盒法檢測結(jié)果的比較分析：從某超市中隨機(jī)選購3種不同品牌的紅酒，分別采用本研究中建立的ELISA試劑盒法和GC—MS法檢測紅酒中塑化劑的含量，對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。每一種紅酒進(jìn)行檢測時做2次平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC—MS法加標(biāo)回收分析

在本試驗(yàn)條件下，1mg/kg混標(biāo)中的16種塑化劑均已分離開來，且峰形良好，見圖1。通過對紅酒進(jìn)行加標(biāo)處理，分析紅酒加標(biāo)回收率來驗(yàn)證該方法的精準(zhǔn)度。其加標(biāo)平均回收率為93.0%，最高為109.0%，最低為68.0%，其中常見塑化劑 DIBP、DBP、DEHP的回收率分別為80.0%，90.0%，90.0%，回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.00～0.35（見表1）。較高的回收率以及較小的標(biāo)準(zhǔn)偏差表明本試驗(yàn)建立的紅酒塑化劑GC—MS法檢測精確度好，符合試驗(yàn)的要求。

圖1 混標(biāo)（1mg/kg）在SIM掃描模式下的總離子流色譜圖Figure 1 The chromatograms of 16phthalate esters under SIM mode

2.2 GC—MS法和ELISA試劑盒法的比較分析

2.2.1 兩種不同前處理方法的比較分析 采用兩種不同的前處理方法對樣品進(jìn)行前處理，通過GC—MS進(jìn)行檢測，得出紅酒中所含塑化劑的主要種類為DIBP、DBP、DEHP（見圖2）。兩種不同前處理方法的處理過程中有很大不同，但其檢測值卻相差不大（表2），說明兩種前處理方法對于塑化劑的萃取效果較為一致，故ELISA試劑盒法前處理能夠?qū)⑺芑瘎臉悠分泻芎玫剌腿〕鰜怼?/p>

表1 混標(biāo)在紅酒中的加標(biāo)回收試驗(yàn)Table 1 Results of the PEAs standard recovery test in red wine

表1 混標(biāo)在紅酒中的加標(biāo)回收試驗(yàn)Table 1 Results of the PEAs standard recovery test in red wine

添加水平1.0mg/kg。

序號 化合物名稱 加標(biāo)回收率 序號 化合物名稱 加標(biāo)回收率1 DMP 0.68±0.08 9 DHXP 1.04±0.13 2 DEP 0.85±0.13 10 BBP 0.96±0.06 3 DIBP 0.80±0.10 11 DBEP 1.04±0.08 4 DBP 0.90±0.00 12 DCHP 0.97±0.01 5 DMEP 0.90±0.11 13 DEHP 0.90±0.06 6 BMPP 0.94±0.05 14 DR 0.87±0.10 7 DEEP 0.97±0.16 15 DNOP 1.06±0.16 8 DPP 0.96±0.02 16 DNP 1.09±0.35

圖2 不同前處理法的紅酒在SIM掃描模式下的總離子流色譜圖Figure 2 The chromatograms of red wine under SIM mode for different pre-treatment methods

2.2.2 GC—MS法和ELISA試劑盒法檢測結(jié)果的比較分析

（1）制作DBP標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用試劑盒自帶的DBP標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝－1.041 2ln（x）＋0.168 9，R2＝0.990 9（見圖3）。

表2 兩種不同前處理法GC—MS檢測值Table 2 The GC—MS detection of two different pre-treatments （mg·kg－1）

圖3 DBP標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 DBP standard curve on color results

（2）檢測結(jié)果的比較分析：將3種不同品牌的紅酒，編號為A、B、C，分別采用試劑盒法和GC—MS法進(jìn)行檢測。其檢測結(jié)果的比較見表3。由表3可知，試劑盒法的檢測值比GC—MS法的檢測值要大3.4～5.5倍。其原因可能是試劑盒法在檢測過程中采用的是人工操作，受外界的影響較大，而GC—MS法在檢測過程中完全是由儀器的自動運(yùn)行，外界干擾對其影響很小。故比GC—MS法的檢測值大3.4～5.5倍，在可接受范圍內(nèi)。

表3 試劑盒法與GC—MS法的對比分析Table 3 ELISA kits and GC—MS for comparative analysis of plasticizers in red wine

3 結(jié)論

本研究中建立的GC—MS法對于紅酒中塑化劑的檢測具有高精準(zhǔn)度，能夠準(zhǔn)確地檢測樣品中塑化劑的具體含量。由于ELISA試劑盒法是基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)，而酶聯(lián)免疫反應(yīng)自身具有很強(qiáng)的特異性，故ELISA試劑盒法可以對樣品中塑化劑進(jìn)行定性分析。通過將ELISA試劑盒法對DBP的檢測結(jié)果與GC—MS法的比較分析，發(fā)現(xiàn)試劑盒法的檢測值比GC—MS法的檢測值要大3.4～5.5倍，但考慮到試劑盒法在檢測過程中采用的是人工操作，受外界的影響較大，而GC—MS法在檢測過程中完全是由儀器的自動運(yùn)行，外界的干擾對其影響很小，故ELISA試劑盒法的檢測結(jié)果是可以接受的，因此鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）ELISA試劑盒能夠?qū)t酒中的DBP進(jìn)行快速的初步定量分析。在本研究中通過GC—MS法檢測到紅酒中主要含有3種塑化劑（DIBP，DBP，DEHP），但只對鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）進(jìn)行了酶聯(lián)免疫檢測，研究結(jié)果只能說明DBP的ELISA試劑盒法符合快速檢測的要求，但不能驗(yàn)證其他塑化劑ELISA試劑盒法的檢測效果。本研究對紅酒中塑化劑的分析檢測具有參考意義和實(shí)際應(yīng)用價值。

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