溫度對金帶細鲹魚肉水解物美拉德反應及其產(chǎn)物抗氧化性的影響

盧 彬 王忠合 王 軍 鄒 敏 傅 力

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.韓山師范學院生物系，廣東 潮州 521041）

近年來，有關魚類蛋白酶水解物抗氧化活性的研究引起了人們的廣泛關注，如鰱魚蛋白［1］、羅非魚內(nèi)臟蛋白［2］、金帶細鲹魚肉蛋白［3］、金槍魚肝臟蛋白［4］等。雖然酶水解產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性，但遠不如人工合成的抗氧化劑活性高［5］。美拉德反應是食品中羰基和氨基之間的非酶促褐變反應［6］。美拉德反應不僅能使食品具有獨特的風味和誘人的色澤，而且美拉德反應產(chǎn)物（maillard reaction products，MRPs）中的類黑素、還原酮及一些含氮硫的雜環(huán)化合物均具有較強的抗氧化活性［7］。劉蒙蒙等［8］研究表明，羅非魚魚皮膠原肽與葡萄糖發(fā)生美拉德反應后，產(chǎn)物的抗氧化性相較于原膠原肽有顯著提高。尤娟等［9］發(fā)現(xiàn)，鰱魚魚肉蛋白酶水解物與葡萄糖在60℃下，以1∶4（m∶m）的比例進行糖基化反應，得到的MRPs清除DPPH自由基能力較強。

金帶細鲹（Selaroidesleptolepis）為近海暖水性魚類，體長可達18cm，中國產(chǎn)于南海、臺灣海峽，攝食浮游動物和底棲動物，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素類、鈣等營養(yǎng)元素，且價格相對較低。作為原料加工的產(chǎn)品多為一些脫水魚干、魚粉等低附加值產(chǎn)品，也是一種未充分利用的大宗低值魚。本研究擬以金帶細鲹魚肉蛋白為原料，研究溫度對金帶細鲹魚肉蛋白水解物美拉德反應及其MRPs抗氧化活性的影響，進一步分析MRPs中具有抗氧化活性組分的產(chǎn)生過程、在整個反應過程中的變化趨勢以及抗氧化形成機理，旨在為金帶細鲹魚高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

金帶細鲹：購于廣東省潮州市楓春市場；

胰蛋白酶：3 000～3 500NFU/mg，生工生物工程（上海）有限公司；

菲洛嗪、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）：分析純，美國Sigma公司；

葡萄糖：分析純，廣東光華化學廠有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：UV-2800型，尤尼科（上海）儀器有限公司；

冷凍干燥機：FD-1D-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

離心機：2-16P型，美國Sigma公司；

pH計：PHSJ-4A型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

電子恒溫水浴鍋：B056028型，深圳市國華電子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 魚肉蛋白水解物的制備 魚肉糜按質(zhì)量比1∶3的比例與水混合，用6mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，酶解溫度為50℃，加1%（m/m）的胰蛋白酶（［E］/［S］＝1∶100）酶解3h，在酶解過程中用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH不變。酶解結束后100℃滅酶10min，將酶解液在10 000r/min離心10min，上清液冷凍干燥24h后，將制備好的水解物置于密封袋中，在－18℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同條件下美拉德反應體系的制備 將制備好的水解物溶解在蒸餾水中，按魚肉蛋白水解物與葡萄糖質(zhì)量比1∶2加入葡萄糖，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，最后將魚肉蛋白水解物濃度為25mg/mL的溶液置于20mL具塞密閉試管中分別在100，120 ℃下反應0，1，2，3，4，5，6h（MRPs-100、MRPs-120分別表示100，120 ℃下所得的反應產(chǎn)物）。反應完畢后，立即取出置于冰水冷卻至室溫，測定pH值，然后置于－18℃冷凍備用。同時按上述相同試驗條件，以不加葡萄糖的作為對照（對照-100、對照-120分別表示在100，120℃單獨加熱的魚肉蛋白水解物）。

1.2.3 中間產(chǎn)物和褐變程度的測定 根據(jù)文獻［10］修改如下：反應樣液用蒸餾水稀釋100倍和50倍，以蒸餾水做參比，分別在294nm和420nm下測定吸光度。

1.2.4 游離氨基含量的測定 根據(jù)文獻［11］修改如下：取用蒸餾水稀釋25倍后的樣液125μL，加入0.212 5mol/L pH 8.2的磷酸鹽緩沖液2.0mL和0.01%的TNBS溶液1.0mL，混勻，置于50℃水浴中暗處反應30min。反應后加入0.1mol/L的亞硫酸鈉2.0mL終止反應，室溫下冷卻15 min，于420nm處測定吸光度。以L-亮氨酸為標樣繪制標準曲線。游離氨基含量表示為處理后的樣液的游離氨基數(shù)占處理前樣液游離氨基數(shù)的百分比。

1.2.5 美拉德反應產(chǎn)物抗氧化活性的測定

（1）DPPH自由基清除率：根據(jù)文獻［12］修改如下：稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.15mmol/L的溶液。取2mL用蒸餾水稀釋25倍后的樣品溶液與2mL DPPH溶液混合均勻，室溫暗處反應30min后，于517nm處測定吸光度A2。同時測定2mL DPPH與2mL無水乙醇溶液混合后的吸光度A0；2mL樣液與2mL無水乙醇溶液混合后吸光度A1。DPPH自由基的清除率用式（1）計算：

式中：

R——DPPH自由基清除率，%；

A0——乙醇加DPPH溶液的吸光度；

A1——乙醇加樣液的吸光度；

A2——樣液加DPPH溶液的吸光度。

（2）還原力：根據(jù)文獻［13］修改如下：在10mL離心管中分別加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液2mL和用蒸餾水稀釋25倍后的樣品溶液2mL，加入1%鐵氰化鉀2 mL，混合均勻后于50℃反應20min。取出加入2mL 10%三氯乙酸終止反應，5 000r/min離心10min。取上清液2 mL，加入去離子水2mL和FeCl30.5mL，混勻后靜置10 min，在700nm處檢測吸光度。吸光度的大小表示還原力的強弱。

（3）羥自由基清除率：根據(jù)文獻［14］修改如下：取用蒸餾水稀釋25倍后的樣品溶液1mL，加入9mmol/L FeSO40.25mL和9mmol/L水楊酸—乙醇溶液0.25mL，混勻后，加入1.5mL蒸餾水。最后加1mL 8.8mmol/L H2O2啟動反應，在37℃反應30min，以蒸餾水為參比，在510nm下測定各樣液的吸光度A2。以1mL蒸餾水代替樣液，測定在510nm處的吸光度A0；以1mL蒸餾水代替H2O2，測定在510nm處的吸光度A1。按式（2）計算羥自由基清除率：

式中：

R——羥自由基清除率，%；

A0——蒸餾水代替樣液后在510nm處的吸光度；

A1——蒸餾水代替H2O2后在510nm處的吸光度；

A2——加入樣液后在510nm處的吸光度。

（4）Fe2＋螯合力的測定：根據(jù)文獻［15］修改如下：取用去離子水稀釋25倍后的樣品溶液1mL，加入去離子水1.85mL和2mmol/L的FeCl2溶液0.05mL，混合均勻室溫靜置30s，再加入5mmol/L的菲洛嗪溶液0.1mL，室溫下靜置10min，3 000r/min離心5min后于562nm處測定其吸光度A2。以1mL去離子水代替樣液，測定在562nm處的吸光度A0；以0.1mL去離子水代替菲洛嗪，測定562nm處的吸光度A1。按照式（3）計算螯合力：

式中：

R——Fe2＋螯合力，%；

A0——去離子水代替樣液后在562nm處的吸光度；

A1——去離子水代替菲洛嗪后在562nm處的吸光度；A2——加入樣液后在562nm處的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗重復測定3次，結果表示為平均值±標準偏差SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件進行一維方差分析（oneway ANOVA），差異顯著性采用Duncan（鄧肯）檢驗，檢驗水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 魚肉水解物水解度的測定

前期試驗發(fā)現(xiàn)，采用胰蛋白酶水解金帶細鲹魚肉3h后，水解物的抗氧化性和功能特性較好，測定水解度為20.18%。

2.2 反應產(chǎn)物pH值的變化

由圖1可知，MRPs-100的pH值隨著反應時間的延長緩慢降低（P＜0.05）。MRPs-120的pH 值在前4h急劇降低（P＜0.05），4h后pH值趨于平緩。pH值的降低主要是因為美拉德反應過程中糖和水解產(chǎn)物受熱發(fā)生降解生成一些有機酸，包括甲酸和乙酸以及其他可能形成的乳酸、丙酮酸、檸檬酸和糖精酸等［13］。對照組pH值無顯著變化（P＞0.05）。

2.3 中間產(chǎn)物和褐變程度的變化

如圖2所示，MRPs-120的A294nm和A420nm顯著高于MRPs-100下的吸光值（P＜0.05）。此結果與 Yilmaz等［16］的研究相一致，MRPs-120的顏色與MRPs-100相比，變?yōu)楦畹纳詈稚?。對照?00，120℃）的A294nm無明顯變化，而A420nm略有升高，原因可能是金帶細鲹水解產(chǎn)物中含有少量的還原糖，加熱導致還原糖的焦糖化反應或者糖與肽之間的美拉德反應。

圖1 美拉德反應產(chǎn)物的pH值隨時間的變化Figure 1 Changes in pH value of MRPs as a function of reaction times

圖2 美拉德反應產(chǎn)物的中間產(chǎn)物和褐變程度隨時間的變化Figure 2 Changes in the intermediate compounds and the browning intensity of MRPs as a function of reaction times

2.4 游離氨基含量的變化

游離氨基的含量變化是用來比較美拉德反應程度的指標［17］。如圖3所示，反應最初2h游離氨基的含量迅速下降，反應2h時MRPs-120的游離氨基的損失速率是 MRPs-100的2.88倍，反應2h之后游離氨基的含量變化不顯著（P＞0.05）。在美拉德反應的初期階段，肽類或者蛋白質(zhì)的α－氨基和賴氨酸殘基的ε－氨基與葡萄糖的羰基發(fā)生反應，造成這些高活性游離氨基大量減少，而其它氨基難以被利用，因而加熱處理后期游離氨基含量變化不明顯［18］。對照組游離氨基酸的含量無顯著變化（P＞0.05）。

2.5 DPPH自由基清除活性

如圖4所示，反應時間前3h內(nèi)，MRPs-120的DPPH清除率顯著增大，在4～6h時趨于平緩。而MRPs-100的DPPH自由基清除率顯著低于 MRPs-120（P＜0.05）。MRPs-100、MRPs-120對 DPPH 自由基清除率最大值分別為26.12%和82.70%。對照組DPPH自由基清除活性隨著反應時間延長略微增大，當在6h時，對照-120的DPPH自由基清除率只達到19.04%。研究發(fā)現(xiàn)MRPs的DPPH自由基清除活性在一定程度上與褐變程度有關，這可能是因為美拉德反應在高級階段會形成褐色高分子聚合物類黑精，此類物質(zhì)具有顯著的抗氧化性［19］。

圖3 美拉德反應產(chǎn)物的游離氨基含量隨時間的變化Figure 3 Changes in free amino group content of MRPs as a function of reaction times

圖4 美拉德反應產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨時間的變化Figure 4 Changes in DPPH radical scavenging activity of MRPs as a function of reaction times

2.6 還原力

如圖5所示，隨著反應時間的延長，MRPs-100和MRPs-120的還原力都顯著增大（P＜0.05），相比于 MRPs-100，MRPs-120表現(xiàn)出了較強的還原力。反應6h后，MRPs-120的還原力是 MRPs-100的2.16倍，是對照-120的7.19倍。Jiang等［20］也發(fā)現(xiàn)，在整個美拉德反應過程中，MRPs的還原能力隨反應時間的增加而增加。對照組反應6 h后其還原力無明顯變化（P＞0.05）。

2.7 羥基清除活性

由圖6可知，隨著反應時間的延長，MRPs-100和MRPs-120的羥基清除率逐漸降低，相比未反應前分別降低11.81%和17.27%。而對照組羥基清除率基本沒有變化（P＞0.05）。結果說明美拉德反應使金帶細鲹魚肉水解產(chǎn)物的羥基清除活性下降。這與劉蒙蒙等［8］的研究結果不一致。

圖5 美拉德反應產(chǎn)物的還原力（A700nm）隨時間的變化Figure 5 Changes in Reducing power of MRPs as a function of reaction times

圖6 美拉德反應產(chǎn)物的羥自由基清除率隨時間的變化Figure 6 Changes in Hydroxyl radical scavenging activity of MRPs as a function of reaction times

2.8 Fe2＋螯合能力

如圖6所示，隨著反應時間的延長，對照組Fe2＋螯合力無顯著變化（P＞0.05），MRPs-100的Fe2＋螯合力略有減少，反應6h后其Fe2＋螯合力相比對照-100減少5.60%，而MRPs-120的Fe2＋螯合力顯著減少，反應6h后其Fe2＋螯合力相比未反應前減少67.37%。其原因可能是因為金帶細鲹魚肉水解產(chǎn)物中一些游離氨基酸、肽鏈和蛋白質(zhì)，其側鏈上的氨基和羧基能與Fe2＋配位，但高溫下美拉德反應使這類物質(zhì)大量減少，導致Fe2＋螯合能力也隨之減弱［21］。

圖7 美拉德反應產(chǎn)物的Fe2＋螯合率隨時間的變化Figure 7 Changes in Fe2＋chelating ability of MRPs as a function of reaction times

3 結論

（1）當反應溫度為120℃時，反應體系的pH值和游離氨基酸含量與100℃時相比顯著降低，中間產(chǎn)物及褐變程度急劇增加，對照組沒有顯著變化。說明較高的反應溫度下，能夠促進金帶細鲹魚肉蛋白水解物與葡萄糖美拉德反應的進行。

（2）當反應溫度為120℃時，反應產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和還原力與100℃時相比大幅度提高，對照組沒有顯著變化。有研究表明［19］DPPH自由基清除率和還原力在一定程度上與褐變程度有關，可能是因為美拉德反應在高級階段會形成褐色高分子聚合物類黑精，此類物質(zhì)具有顯著的抗氧化性。而羥基清除率和Fe2＋螯合力的降低，可能是因為某種游離氨基酸或肽的含量大量減少導致，具體原因還有待進一步的研究探討。

（3）雖然較高反應溫度夠促進美拉德反應的進行和抗氧化活性物質(zhì)的生成，但也會生成一些對人體有害的物質(zhì)如中級產(chǎn)物羥甲基糠醛、丙烯酰胺和晚期產(chǎn)物羧甲基賴氨酸等。如何抑制此類物質(zhì)的生成，而又不影響MRPs的抗氧化活性，需進一步的分析研究。

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