氣相色譜—質(zhì)譜法測(cè)定食用檳榔中對(duì)羥基苯甲酸乙酯的測(cè)量不確定度評(píng)定

陳幸鶯

（湘潭市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 湘潭 411100）

測(cè)量不確定度是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)［1］。一個(gè)完整的測(cè)量結(jié)果，除了應(yīng)給出被測(cè)量的最佳估計(jì)值外，還應(yīng)同時(shí)給出測(cè)定結(jié)果的不確定度。食用檳榔作為一種果實(shí)加工食品，因原產(chǎn)地和生產(chǎn)加工地域不同、防腐保質(zhì)要求較高等特點(diǎn)，加工過(guò)程中對(duì)食品添加劑、防腐劑方面有較高的要求。湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 43/132—2004《食用檳榔》中規(guī)定，防腐劑脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸酯可用于食用檳榔加工。其中對(duì)羥基苯甲酸酯作為毒性較低的一種廣譜防腐劑，被包括美國(guó)、歐盟、中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家允許應(yīng)用于食品。DB 43/132—2004中也規(guī)定，檳榔食品中對(duì)羥基苯甲酸酯添加量為0.5g/kg（以對(duì)羥基苯甲酸計(jì)）。但近年來(lái)有研究［2］報(bào)道對(duì)羥基苯甲酸酯類有潛在的雌激素活性，對(duì)人體健康安全有一定的影響，專家要求重新評(píng)定對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的每日允許攝入量等安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究擬采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定食用檳榔中對(duì)羥基苯甲酸乙酯含量，并依據(jù)JJF 1059.1－2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》的規(guī)定找出影響不確定度的各種因素，合成不確定度及擴(kuò)展不確定度，為其測(cè)定方法的探討和檢測(cè)結(jié)果的評(píng)估提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 原理

樣品酸化后，對(duì)羥基苯甲酸酯類用乙酸乙酯提取后，經(jīng)氣相色譜進(jìn)行分離，以特征離子峰進(jìn)行定性定量。

1.2 儀器和試劑

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975C型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

電子天平：BS210S型，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；

乙酸乙酯：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

對(duì)羥基苯甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：GBW（E）100064，相對(duì)擴(kuò)展不確定度0.2%，k＝2，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。

1.3 測(cè)量條件

1.3.1 色譜條件 載氣：高純氦氣（99.999%）；色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；柱流速：1.0mL/min；分流比：10︰1；汽化室溫度：250℃；柱溫程序：初始溫度50℃，保持1min，以10℃/min速率升溫至200℃，保持3min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 傳輸線溫度：220℃；離子源溫度：250℃；離子化方式：EI；電子能量：70eV；延遲時(shí)間2.0min；檢測(cè)方式：全掃描；質(zhì)量范圍：m/z25～300。

1.4 測(cè)量過(guò)程

稱取10g試樣（精確至0.000 1g），加1mL鹽酸（1＋1）（V/V）酸化，加10mL飽和氯化鈉溶液、準(zhǔn)確加入10.00mL乙酸乙酯渦旋2min，超聲提取20min，棄去水層。加入10 mL碳酸氫鈉溶液（1g/100mL），渦旋2min，靜置10min，8 000r/min離心15min，取上清液過(guò)濾膜供質(zhì)譜測(cè)定。

1.5 質(zhì)譜圖

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)得對(duì)羥基苯甲酸乙酯的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)羥基苯甲酸乙酯質(zhì)譜圖Figure 1 P-hydroxy benzoic acid ethyl ester mass spectrogram

圖2 不確定度來(lái)源Figure 2 The sources of uncertainty

2 測(cè)量不確定度評(píng)定

由測(cè)量所得的測(cè)得值只是被測(cè)量的估計(jì)值，測(cè)量過(guò)程中的系統(tǒng)效應(yīng)及隨機(jī)效應(yīng)均會(huì)導(dǎo)致測(cè)量不確定度。對(duì)于檢測(cè)結(jié)果除了給出最優(yōu)的估計(jì)值外，其相對(duì)不確定度評(píng)估也相當(dāng)重要。本研究依據(jù)JJF 1059.1－2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》的方法，建立食用檳榔中對(duì)羥基苯甲酸酯類測(cè)定結(jié)果的數(shù)學(xué)模型，找尋不確定來(lái)源，并對(duì)不同類別的不確定度分量進(jìn)行評(píng)定，合成不確定度及擴(kuò)展不確定度。

2.1 測(cè)量數(shù)學(xué)模型

根據(jù)本研究的檢驗(yàn)原理，評(píng)定對(duì)羥基苯甲酸乙酯測(cè)量結(jié)果不確定度的數(shù)學(xué)模型可以用式（1）表示：

式中：

X——被測(cè)食用檳榔樣品中對(duì)羥基苯甲酸乙酯含量，g/kg；

c——上機(jī)待測(cè)液濃度，mg/mL；

v——提取液體積，mL；

m——樣品的質(zhì)量，g。

2.2 不確定度來(lái)源分析

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定食用檳榔中對(duì)羥基苯甲酸乙酯的不確定度分量主要來(lái)自以下幾個(gè)方面［3－9］（圖2）。

2.3 測(cè)量不確定度評(píng)定

2.3.1 重復(fù)性試驗(yàn)引入的不確定度 在重復(fù)性條件下，食用檳榔樣品10次測(cè)定對(duì)羥基苯甲酸乙酯含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。重復(fù)性引入的不確定度屬A類評(píng)定。

表1 重復(fù)性測(cè)定樣品的結(jié)果Table 1 Repeated measurements of the sample results

計(jì)算測(cè)得的樣品含量平均值為：

用貝塞爾公式計(jì)算試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差：

重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

重復(fù)性引入的相對(duì)不確定度為：

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度評(píng)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值引起的不確定度：本試驗(yàn)方法中擬合校正曲線及分析樣品時(shí)選用的對(duì)羥基苯甲酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［編號(hào)GBW（E）100064］，證書(shū)提供標(biāo)準(zhǔn)值為99.7%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.2%，k＝2，其相對(duì)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度：天平稱量時(shí)對(duì)示值量化的不確定度服從均勻分布。天平分辨力為0.1mg，區(qū)間半寬度為0.05mg，由此引入的相對(duì)不確定度為：

同一樣品連續(xù)稱重3次，采用極差法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差［3］：S（m）＝R/C，其中R為極差，R＝0.000 2g；C為極差系數(shù)，經(jīng)查表n＝3時(shí)極差系數(shù)為1.69，則相對(duì)不確定度為：

合成天平稱量不確定度：

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時(shí)引入的不確定度：本試驗(yàn)方法中對(duì)羥基苯甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，是稱取0.05g標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯溶解，準(zhǔn)確定容至50mL容量瓶中。分別移取0.5，1，2，3，4，5mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液到10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。在此過(guò)程中的不確定度，主要由所用的1mL A級(jí)吸量管，10，50mL容量瓶的不確定度和溫度影響的不確定度組成。

①1mL A級(jí)吸量管引入的不確定度：根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，1mL A級(jí)吸量管的最大允差為±0.007mL。按均勻分布，引入的不確定度為：

1mL吸量管校正溫度為20℃，試驗(yàn)溫度15℃，溫度波動(dòng)5℃，乙酸乙酯膨脹系數(shù)是1.38×10－3℃－1，按均勻分布考慮，溫度引入的不確定度為：

其相對(duì)不確定度為：

② 同理，10mL容量瓶引入的不確定度為：

溫度引入的不確定度為：

其相對(duì)不確定度為：

③ 同理，50mL容量瓶引入的不確定度為：

溫度引入的不確定度為：

其相對(duì)不確定度為：

則配制標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)程中引入的相對(duì)不確定度為：

（4）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對(duì)不確定度：

2.3.3 稱量引入的不確定度評(píng)定 樣品稱量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量為同一天平，同2.3.2，天平引入的相對(duì)不確定度為：

同一樣品連續(xù)稱重3次，相對(duì)不確定度為：

合成天平稱量不確定度：

2.3.4 提取液體積引入的不確定度評(píng)定 本試驗(yàn)方法提取溶液體積為10.00mL，同2.3.2，10.00mL吸量管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

溫度引入的不確定度為：

其相對(duì)不確定度為：

2.3.5 儀器引入的不確定度

（1）自動(dòng)進(jìn)樣針進(jìn)樣體積引入的不確定度：10μL氣相色譜自動(dòng)進(jìn)樣針示值最小刻度為0.2μL，實(shí)際最大誤差以0.02μL計(jì)［4］，進(jìn)樣體積1μL，進(jìn)樣體積服從均勻分布，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）載氣流速引入的不確定度：JJG 700—1999中對(duì)于載氣流速穩(wěn)定性的要求是：10min之內(nèi)，波動(dòng)范圍不超過(guò)±1%。本試驗(yàn)以此上限和下限來(lái)考核評(píng)定載氣流速引入的不確定度。

（3）氣相色譜柱箱溫度控制引入的不確定度：JJF 1164—2006中對(duì)于氣相色譜柱箱溫度穩(wěn)定性的要求是：10 min之內(nèi)，程序升溫重復(fù)性優(yōu)于±2%。本試驗(yàn)以此上限和下限來(lái)考核評(píng)定載氣流速引入的不確定度。

（4）GC—MS重復(fù)性引入的不確定度：在重復(fù)性條件下，對(duì)同一對(duì)羥基苯甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)行10次測(cè)定，所得峰面積見(jiàn)表2。重復(fù)性引入的不確定度屬A類評(píng)定。

表2 對(duì)羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積Table 2 Peak area of p-hydroxy benzoic acid ethyl ester standard solution

計(jì)算測(cè)得的對(duì)羥基苯甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積平均值為：

用貝塞爾公式計(jì)算試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差：

重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

重復(fù)性引入的相對(duì)不確定度為：

（5）合成儀器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.6 樣品測(cè)定過(guò)程產(chǎn)生的不確定度

（1）校正曲線擬合引入的不確定度：對(duì)各對(duì)羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定3次（表3），以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

得擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝ax＋b，a＝7 247 721 014.57，b＝0，R2＝0.999 4。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度ucu由式（2）計(jì)算［3］：

表3 對(duì)羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積峰面積AiTable 3 Peak area of p-hydroxy benzoic acid ethyl ester standard solution

其中：

式中：

S——擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

a——標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，7 247 721 014.57；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線截距，0；

n——標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)數(shù)，18；

p——樣品重復(fù)測(cè)定次數(shù)，10；

Ci——標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度值，mg/mL；

——標(biāo)準(zhǔn)濃度Ci對(duì)應(yīng)的平均峰面積。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度：

（2）回收率引入的不確定度：氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定食品中對(duì)羥基苯甲酸乙酯含量，要經(jīng)過(guò)渦旋提取、超聲提取、離心沉淀、過(guò)濾膜等步驟。如果對(duì)每一步驟進(jìn)行不確定度評(píng)定，部分難以確定的因素評(píng)定起來(lái)會(huì)有一定的難度，本試驗(yàn)方法以回收率來(lái)進(jìn)行綜合評(píng)定。待測(cè)樣在回收率的試驗(yàn)中，是被設(shè)定為與實(shí)際檢測(cè)進(jìn)程相同的載體條件。

對(duì)食用檳榔中對(duì)羥基苯甲酸乙酯進(jìn)行回收率試驗(yàn)，6次試驗(yàn)結(jié)果回收率在91.4%～112.1%，回收率的可能值的上界、下界與最佳估計(jì)值100%不對(duì)稱。在有效信息短缺的情況下，按均勻分布來(lái)處理不確定度評(píng)定，由此產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用式（4）計(jì)算［5］：

式中：

U（rec）——樣品測(cè)定過(guò)程中回收率的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

b＋——回收率按其估計(jì)值的偏差上限；

b-——回收率按其估計(jì)值的偏差下限；

k——回收率界限不對(duì)稱時(shí)，k＝12。

相對(duì)不確定度為：

樣品測(cè)定過(guò)程產(chǎn)生的不確定度：

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜上所述，各不確定度分量對(duì)合成不確定度的影響分布見(jiàn)圖3。

圖3 測(cè)量不確定度分量分布示意圖Figure 3 Distribution diagram of each component of uncertainty

在不考慮各輸入量之間的相關(guān)性的情況下，以方和根合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.5 擴(kuò)展不確定度

在置信概率取95%的情況下，包含因子k＝2。相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

由試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值計(jì)算得該食用檳榔樣品中對(duì)羥基苯甲酸乙酯含量的最佳估計(jì)值：

X＝0.186（g/kg）

故其擴(kuò)展不確定度為：

U95＝0.186×0.127≈0.024（g/kg）

該食用檳榔樣品中對(duì)羥基苯甲酸乙酯含量的測(cè)量不確定度報(bào)告：

X＝（0.186±0.024）g/kg（包含因子k＝2，置信概率95%）。

3 結(jié)論

以氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定食用檳榔中對(duì)羥基苯甲酸乙酯為例，對(duì)測(cè)定食用檳榔中對(duì)羥基苯甲酸乙酯的測(cè)量不確定度來(lái)源進(jìn)行了分析和量化評(píng)定，結(jié)果表明測(cè)定過(guò)程中的回收率、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀、測(cè)量重復(fù)性分量對(duì)不確定度的影響較大，而質(zhì)量、提取液體積等對(duì)測(cè)量不確定度影響較小。因此要減小不確定度，得到準(zhǔn)確性高的測(cè)量結(jié)果，應(yīng)選用穩(wěn)定性好的儀器、選擇合理的測(cè)定方法，并規(guī)范檢驗(yàn)操作。

1 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJF 1059.1－2012測(cè)量不確定度評(píng)定與表示［S］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2012.

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