丙氨酰-谷氨酰胺對斷奶仔豬小腸黏膜固有層免疫球蛋白A漿細胞數(shù)量、分泌型免疫球蛋白A及黏膜中白細胞介素含量的影響

葉亞玲 王自蕊 游金明 鄧宸璽 辛向榮

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省動物營養(yǎng)重點實驗室，南昌 330045)

斷奶時期是仔豬由被動免疫向主動免疫的過渡階段，也是仔豬免疫功能的調(diào)節(jié)時期。3周齡左右斷奶的仔豬，其免疫功能尚不完善，產(chǎn)生的主動免疫水平較低，抗病力較弱［1］。仔豬本身的免疫水平?jīng)Q定了機體的健康狀況和藥物使用情況，并間接影響著豬肉產(chǎn)品的質(zhì)量與安全。因此，從源頭上調(diào)節(jié)仔豬的免疫系統(tǒng)，提高仔豬的免疫力是解決上述問題的關(guān)鍵。研究表明，適量補充谷氨酰胺(glutamine，Gln)能有效提高仔豬的免疫力，緩解仔豬的斷奶應(yīng)激［2-5］。小腸是機體最大的免疫器官，小腸黏膜在仔豬局部免疫中發(fā)揮著重要的防御作用。Gln作為仔豬的一種條件性必需氨基酸［6］，可為小腸黏膜的細胞分化提供能量和氮源，進而促進受損腸黏膜的修復(fù)以及維持正常的局部免疫功能［7-9］。但由于斷奶中斷了仔豬獲得母源性Gln，加上自身合成谷氨酰胺的能力有限，仔豬往往容易缺乏Gln。因此，外源性地添加Gln對緩解仔豬斷奶應(yīng)激，增強斷奶仔豬免疫功能具有十分重要的意義。小腸黏膜固有層免疫球蛋白A(IgA)漿細胞數(shù)量、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)及黏膜中白細胞介素含量是反映仔豬免疫水平的重要指標(biāo)。因此，本試驗通過在斷奶仔豬飼糧中添加不同水平的丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)，觀察Ala-Gln對仔豬腸道黏膜固有層IgA漿細胞數(shù)量、SIgA及白細胞介素含量等黏膜免疫指標(biāo)的影響，為指導(dǎo)Ala-Gln在仔豬飼糧中的科學(xué)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用Ala-Gln購自上海超強化工有限公司，分子式為C8H15N3O4，相對分子質(zhì)量為217.22，純度≥99.0%。

1.2 動物分組

根據(jù)遺傳背景和體重相近原則，選用100頭(6.7±0.9)kg、(21±2)日齡斷奶的長白×大白仔豬，按完全隨機區(qū)組設(shè)計分為4個組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)5頭仔豬。

1.3 飼糧設(shè)計與飼養(yǎng)管理

對照組仔豬飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，其他各組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.15%、0.30%、0.45%Ala-Gln的試驗飼糧?；A(chǔ)飼糧參考NRC(2012)和我國豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)推薦的豬營養(yǎng)需要進行配制。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

試驗在正邦集團某原種豬場進行。仔豬飼養(yǎng)于裝有高床、漏縫地板、不銹鋼可調(diào)式料槽、乳頭式飲水器的保育舍。每日飼喂4次(07:30、11:30、15:30、19:30)，自由采食和飲水。其他飼養(yǎng)管理、免疫措施按豬場的常規(guī)程序執(zhí)行。試驗期為21 d。

1.4 樣品采集與制備

于試驗第7、14、21天早晨，從每個重復(fù)中選取1頭接近平均體重的仔豬進行屠宰，打開胸腔，分別在十二指腸、空腸、回腸中段剪取3 cm腸段，用生理鹽水小心沖去食糜，置于10%中性甲醛溶液中固定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

另剪取15 cm空腸，輕輕擠去食糜，用4℃去離子水沖洗。縱向剪開腸壁，在表面皿中展開，濾紙吸水后用載玻片輕輕刮取腸黏膜，裝于無菌凍存管內(nèi)，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱中凍存。準(zhǔn)確稱取1 g左右的黏膜，按1∶9質(zhì)量體積比加入生理鹽水，使用電動勻漿器將黏膜冰浴勻漿，制成懸浮液，然后置冷凍離心機中3 000×g離心10 min(4℃)。分離上清液，即為10%的黏膜勻漿液。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 小腸黏膜固有層IgA漿細胞數(shù)量

1.5.1.1 常規(guī)石蠟切片制作

將固定好的十二指腸、空腸、回腸組織塊修整為適當(dāng)大小，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片、展片、貼片后，置于37℃的恒溫箱內(nèi)烤干，以備染色。

1.5.1.2 小腸 IgA 漿細胞數(shù)量

小腸IgA漿細胞數(shù)量采用二步聚合物免疫組化法進行檢測。步驟如下:

①將烘干后的切片經(jīng)二甲苯脫蠟，從高濃度酒精到低濃度酒精逐級復(fù)水(100%2次、95%、90%、80%、70%、60%)。之后再用蒸餾水洗 5～10 min。

② 將切片置于已加熱至沸騰的0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH=6.0)中，保持沸水浴15 min以修復(fù)抗原。取出切片，冷卻至室溫，吸干。

③ 滴加3%H2O2去離子水，孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。甩干切片，用磷酸鹽(PBS)緩沖液沖洗3次，每次2 min。

④ 滴加一抗——羊抗豬SlgA抗體(bethyl laboratories)。使用時用抗體稀釋液做適當(dāng)?shù)南♂?，最終工作液濃度為1∶200)，切片放入濕盒中，37℃孵育3 h。陰性對照組用PBS代替一抗。PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。

⑤ 滴加試劑1(polymer helper)，室溫孵育10～20 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。

⑥ 滴加試劑2(poly-HRP anti-goat IgG)，室溫孵育 10～20 min，PBS緩沖液沖洗 3次，每次3 min。

⑦應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液避光顯色10 min。

⑧自來水充分沖洗，終止顯色。

⑨ 蘇木紫復(fù)染1 min，自來水沖洗10 min。醇酸分色30 s，自來水洗凈，PBS沖洗10 min。

⑩ 酒精梯度脫水，二甲苯透明8 min，封片。

采用江南BM2000光學(xué)顯微鏡觀察，在相同放大倍數(shù)下隨機選擇10個視野拍照。Image Pro Plus 6.0軟件計數(shù)漿細胞數(shù)量，計算平均值。

1.5.2 小腸黏膜SIgA 含量

取10%的黏膜勻漿液，利用SIgA酶聯(lián)免疫試劑盒(上海博古生物科技有限公司)采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定小腸黏膜中SIgA的含量。向預(yù)先包被了豬SIgA單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入目的蛋白，溫育。加入生物素標(biāo)記的抗SIgA抗體，再與鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合，形成免疫復(fù)合體，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物工作液顯色，最后加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)孔的吸光度(OD)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出對應(yīng)樣品中SIgA含量。

1.5.3 小腸黏膜白細胞介素含量

取10%的黏膜勻漿液，采用125I放射免疫試劑盒測定小腸黏膜中的白細胞介素2(interleukin-2，IL-2)、白細胞介素 5(interleukin-5，IL-5)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)含量。試劑盒均購自上海博古生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，F(xiàn)檢驗組間差異顯著者再進行Duncan氏法多重比較，以分析不同水平的Ala-Gln對斷奶仔豬小腸黏膜固有層IgA漿細胞數(shù)量、SIgA及黏膜中白細胞介素含量的影響。P＜0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.01為差異極顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ala-Gln對斷奶仔豬小腸固有層IgA漿細胞數(shù)量的影響

表2數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比，飼糧添加0.15%～0.45%Ala-Gln 能夠顯著增加仔豬斷奶后第7、14、21天十二指腸以及空腸中固有層IgA漿細胞數(shù)量(P＜0.05)，尤其是 0.30%Ala-Gln 組仔豬在斷奶第14天空腸IgA漿細胞數(shù)量比對照組顯著增加了 22.6%(P＜0.05)。在回腸中，0.30%Ala-Gln組顯著提高了仔豬斷奶后第7、14天IgA漿細胞數(shù)量(P＜0.05)，而其他組與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。

表2 Ala-Gln對斷奶仔豬小腸固有層IgA漿細胞數(shù)量的影響Table 2 Effects of Ala-Gln on the numuber of SIgA plasma cells in gut lamina propria of weaner piglets

2.2 Ala-Gln對斷奶仔豬空腸黏膜SIgA含量的影響

表3數(shù)據(jù)顯示，仔豬斷奶后第7天，空腸黏膜中SIgA的含量隨Ala-Gln添加量的增加呈現(xiàn)明顯的二次曲線變化規(guī)律(P=0.000，R2=0.962)。其中，0.30%Ala-Gln 組 SIgA 含量達 0.167 g/L，比對照組提高 70.4%(P＜0.01)，而 0.15%、0.45%Ala-Gln組與對照組之間差異不顯著(P＞0.05)。仔豬斷奶后第14天，空腸黏膜SIgA含量變化規(guī)律也呈二次曲線變化規(guī)律(P=0.001，R2=0.913)，其中 0.15%、0.30%Ala-Gln組與對照組相比分別提高了 34.9%、64.1%(P＜0.05)，但 0.45%Ala-Gln組SIgA含量與對照組差異不顯著(P＞0.05)。仔豬斷奶后第21天，空腸黏膜SIgA含量變化與第14天相似。

表3 Ala-Gln對斷奶仔豬空腸黏膜SIgA含量的影響Table 3 Effects of Ala-Gln on concentration of SIgA in jejunum mucous of weaner piglets

2.3 Ala-Gln對斷奶仔豬小腸黏膜白細胞介素含量的影響

表4數(shù)據(jù)顯示，飼糧中添加Ala-Gln能夠提高仔豬斷奶后小腸黏膜白細胞介素的含量，有助于仔豬的腸道健康。與對照組相比，在斷奶后第7天，0.15% ～0.30%Ala-Gln 組能夠顯著提高仔豬小腸黏膜中 IL-2、IL-5、IL-6、IL-10 含量(P＜0.05);IL-2、IL-5含量隨著 Ala-Gln的添加量呈現(xiàn)先升高后降低的二次曲線變化規(guī)律，而IL-6、IL-10含量則呈線性升高變化。與對照組相比，在斷奶后第 14天，0.15%Ala-Gln組均使 IL-2、IL-5含量得到顯著提高(P＜0.05);各 Ala-Gln組均顯著提高 IL-6、IL-10 含量(P＜0.05)。與對照組相比，在斷奶后第21天，各Ala-Gln組均顯著提高IL-2、IL-6、IL-10含量，而對IL-5含量無顯著影響(P＞0.05)。

3 討論

3.1 Ala-Gln對斷奶仔豬小腸固有層 IgA漿細胞數(shù)量及SIgA含量的影響

給早期斷奶仔豬補充適量的Ala-Gln能有效防止斷奶應(yīng)激并提高其生產(chǎn)性能。席鵬彬等［10］研究表明，飼糧中添加0.125%和0.250%Ala-Gln可顯著降低“杜×大×長”斷奶仔豬的料重比，并提高飼料利用率。黃冠慶等［11］在給21日齡斷奶仔豬飼糧中添加 0.10%、0.30%Ala-Gln 后發(fā)現(xiàn)，仔豬的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率顯著提高。本研究小組在前期的研究中也獲得了相似的結(jié)果，即飼料中添加0.30%Ala-Gln后，21～35日齡仔豬日增重顯著提高，當(dāng)Ala-Gln添加量由0.15%提高到0.45%時，21～28日齡、29～35日齡、36～42日齡仔豬的腹瀉率和腹瀉指數(shù)呈線性降低趨勢［12］。Ala-Gln對斷奶仔豬的促生長作用源于其對仔豬小腸的保護作用。小腸被認(rèn)為是動物體內(nèi)最大的免疫器官，腸黏膜在小腸局部免疫中發(fā)揮著重要的防御功能。小腸黏膜固有層是機體腸道發(fā)揮免疫應(yīng)答的主要場所，而SIgA是免疫應(yīng)答的重要效應(yīng)分子。當(dāng)機體感受來自抗原的刺激時，將分泌大量的IgA。SIgA通過特殊的空間構(gòu)象或與黏液混合阻斷病原體粘附在黏膜表層，從而發(fā)揮其免疫防御作用［13］。

表4 Ala-Gln對斷奶仔豬小腸黏膜白細胞介素含量的影響Table 4 Effects of Ala-Gln on the content of interleukin in gut lamina propria of weaner pigs pg/mL

Gln是小腸代謝的主要供能物質(zhì)［7］。早期斷奶仔豬通過飼糧攝入的Gln很少，加之自身合成不足，腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷，免疫細胞的增殖下降，這在很多研究中都得到了證實［14-16］。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，Ala-Gln能夠緩解因斷奶應(yīng)激造成的小腸SlgA漿細胞分布的減少。添加0.15%～0.45%Ala-Gln均顯著提高仔豬斷奶后第7、14、21天十二指腸以及空腸黏膜固有層IgA漿細胞數(shù)量。同時，仔豬空腸黏膜SIgA含量隨著Ala-Gln添加量的增加呈二次曲線增長規(guī)律。

Ala-Gln可能是因向腸黏膜固有層免疫細胞提供能量來源和代謝前體，進而影響漿細胞的數(shù)量分布及SIgA的分泌量。研究表明，適量的Ala-Gln在全胃腸外營養(yǎng)(TPN)中可增加大鼠小腸黏膜上皮細胞的DNA含量，促進腸上皮細胞的復(fù)制和分裂［17-18］。對于斷奶仔豬，則可以提高腸上皮細胞和腸系淋巴細胞的增殖［19］。由于SIgA是由漿細胞合成分泌，漿細胞數(shù)量的變化必然會影響SIgA的分泌量，進而影響機體對外來抗原的抵抗力。

本試驗同時表明，仔豬腸黏膜SIgA含量隨Ala-Gln添加量的增加呈先升后降二次曲線變化規(guī)律。當(dāng)Ala-Gln添加量達到0.45%時，SIgA含量恢復(fù)到與對照組一樣的水平。出現(xiàn)這一結(jié)果，可能是由于過高劑量的Ala-Gln進入機體后大量水解成氨基酸單體的緣故。周玉香等［20］研究發(fā)現(xiàn)，頸靜脈灌注中等水平Ala-Gln(每千克體重0.68 g/d)，連續(xù)灌注7 d，可有效提高早期斷奶犢牛骨骼肌蛋白質(zhì)的水平、空腸黏膜DNA含量及骨骼肌和空腸黏膜RNA含量。但對Gln需要量有一定的限度，過量補充只能造成Gln的分解代謝。當(dāng)然，本研究結(jié)果也可能與仔豬獲得了免疫耐受有關(guān)。

3.2 Ala-Gln對斷奶仔豬小腸黏膜中白細胞介素含量的影響

白細胞介素作為免疫系統(tǒng)中的重要信息分子，在免疫調(diào)節(jié)中扮演著十分關(guān)鍵的角色?？乖禺愋訠細胞遷移成熟分化為IgA漿細胞，產(chǎn)生SIgA，這一過程需要白細胞介素的參與。IL-2是活化T淋巴細胞產(chǎn)生的一種多肽類免疫調(diào)節(jié)因子，可促進T、B淋巴細胞的增殖分化和特異性抗體的產(chǎn)生，并最終促進IgA介導(dǎo)的有效免疫應(yīng)答及 SIgA 的有效增加［21］。IL-5、IL-6及 IL-10 可以增強IgA的分泌，促進IgA定向性B細胞的分裂，對漿細胞在黏膜效應(yīng)位點的定位、終末分化、增生及增強IgA的反應(yīng)起關(guān)鍵作用［22-24］。大量研究表明，早期斷奶應(yīng)激易引起仔豬體液免疫和細胞免疫水平下降，并導(dǎo)致腸道炎癥反應(yīng)。腸上皮細胞產(chǎn)生的多種白細胞介素(如 IL-1、IL-2、IL-6、IL-10)參與了腸道的炎癥反應(yīng)［25］。而且腸黏膜固有層T淋巴細胞及其合成分泌的IL-2、IL-5、IL-6等構(gòu)成了固有層IgA陽性及細胞微環(huán)境［26］。應(yīng)激使得仔豬腸上皮細胞促炎因子IL-1含量增加，而抗炎因子 IL-10 快速下降［27］。Fukatsu 等［28］和Yassad-Wozniak等［29］在 TPN中給予谷氨酰胺后發(fā)現(xiàn)，腸道相關(guān)淋巴組織細胞因子維持正常水平，因傳統(tǒng)TPN減少的小腸IgA及小腸勻漿上清液中輔助性T細胞Th2、IL-10含量顯著提高。俞開敏［30］在IL-5及嗜酸性粒細胞對人腸黏膜損傷的研究也發(fā)現(xiàn)，IL-5可延長嗜酸性粒細胞存活時間，促進對牙囊原蟲的免疫應(yīng)答，當(dāng)原蟲刺激人體時，IL-5會迅速合成并作出應(yīng)答。劉濤［31］研究表明，仔豬斷奶后第5天，小腸黏膜IL-6基因表達量顯著下降，斷奶后第11天恢復(fù)到斷奶前水平。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加 0.15%、0.30%Ala-Gln后，仔豬斷奶第7、14天 IL-2、IL-5的含量獲得顯著提高。Ala-Gln同時還顯著提高了各組仔豬IL-6、IL-10的含量。這一結(jié)果表明，Gln可通過影響炎癥因子和白細胞介素，調(diào)節(jié)機體免疫功能。

4 結(jié)論

飼糧中添加Ala-Gln可提高斷奶仔豬斷奶后小腸黏膜固有層IgA漿細胞數(shù)量和SIgA的分泌量，在一定程度上提高腸黏膜白細胞介素的含量，增強機體免疫應(yīng)答，提高斷奶仔豬腸道黏膜免疫。

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