月月桂AACT基因的cDNA全長克隆及生物信息學分析

鄭玉娟，周文化，張黨權，陳麗莉，陳 容，龔建平

（1.中南林業(yè)科技大學 林業(yè)生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 41004；2.稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004；3.湖南澧縣樹大園林有限公司，湖南 澧縣 415513）

月月桂AACT基因的cDNA全長克隆及生物信息學分析

鄭玉娟1,2，周文化2，張黨權1，陳麗莉1，陳 容1，龔建平3

（1.中南林業(yè)科技大學 林業(yè)生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 41004；2.稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004；3.湖南澧縣樹大園林有限公司，湖南 澧縣 415513）

為了克隆分離月月桂AACT（乙酰輔酶A ?；D移酶）全長基因，并研究其基因特征和蛋白結構，以月月桂花瓣RNA為模板，通過反轉錄PCR及RACCE技術分離克隆AACT全長。再利用NCBI網站及生物信息學軟件對其堿基分布、氨基酸組成、親疏水性、二級結構、保守區(qū)及三級結構進行預測和分析，并對10個物種的AACT氨基酸進行多重比對，對基因進行進化分析。分離克隆出AACT基因的cDNA序列長為1580bp,編碼405個氨基酸，該蛋白質相對分子質量為41347.89D，等電點為5.66，其中Ala含量最高為14.53%，平均疏水值為0.215，屬Cond-enzymes超家族。氨基酸序列比對中，胡黃連、假馬齒莧氨基酸序列同源性最高。OsAACT基因穩(wěn)定，編碼的蛋白為疏水性蛋白，其在進化過程中相對保守。試驗獲得的基因信息為萜類物質合成途徑進一步研究奠定基礎。

月月桂；乙酰輔酶A 酰基轉移酶；全長cDNA克?。簧镄畔W分析

月月桂，子房發(fā)育正常的四季桂Osmanthus.fragranscv. Semperf l orens Hort，木犀科木犀屬，主產于我國江蘇、河南、湖南、廣西等省份[1-2]，是優(yōu)良的綠化觀賞植物。月月桂花期長，花淡黃色，微芳香[2-4]。月月桂花香具有寧心靜心，緩解疲勞、頭痛的功效，且能抗菌消炎、止咳平喘，對治療支氣管炎有益。

萜類物質是主要的香氣成分[5-7]，其合成途徑主要包括甲羥戊酸(MVA)途徑和2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑[8]。乙酰輔酶A?；D移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase, AACT)，是細胞質MVA途徑中合成IPP和DMAPP的關鍵調控酶，催化MVA途徑的第一個酶促反應[9]。AACT又稱乙酰乙酰輔酶A硫解酶（Thiolase Ⅱ），屬于?；o酶A代謝酶超家族中的硫解酶（thiolase）家族[10-12]。AACT主要催化2個乙酰輔酶A濃縮形成多個代謝生物合成的起始分子-乙酰乙酰輔酶A。反應機制是：一個乙酰輔酶A釋放CoASH與第二個乙酰輔酶A分子結合，形成?；笍秃衔?；乙酰硫脂鍵斷裂，乙酰乙酰輔酶A形成[12-13]。AACT主要位于胞質和線粒體中。目前，已從擬南芥、蘿卜、向日葵、橡膠、假馬齒莧、苜蓿、油茶、鼠尾草等物種中尋找到AACT的同源基因[10]。Sando等發(fā)現(xiàn)在酵母異源性系統(tǒng)中，橡膠AACT（HbAACT）的表達能促進酵母生長[14]；Soto等提出在高鹽環(huán)境下，AACT能夠促進鯊烯的合成[15]；AACT的過表達還能提高假馬齒莧的抗逆性[10]。因此，AACT在不同物種之間展示出功能多樣性。本研究擬通過RACE技術克隆月月桂AACT（OsAACT）的全長cDNA，并進行生物信息學分析，為揭示桂花花香成分合成規(guī)律提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年9月中旬，在中南林業(yè)科技大學校園內采集月月桂花瓣。采集的樣品清洗后，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設計

分析NCBI中已知其他物種AACT基因序列的特點，依據(jù)保守DNA序列，設計RT-PCR同源克隆引物；基于同源克隆片段測序結果，設計相應的 3’-RACE 與 5’-RACE 引物。

1.3 實驗方法

（1）月月桂花瓣總RNA提取。采用改良的CTAB法/植物RNA試劑盒(Omega)結合法提取和純化總RNA。

（2）OsAACT基因保守片段的RT-PCR克隆。

使用Invitrogen ThermoScript Kit合成cDNA第一鏈。以此為模板，使用引物AACT-F/ AACT-R及Takara Pyrobest酶進行PCR擴增。程序為：預變性（94 ℃，5 min）；變性（94℃，30 s）、退火（58 ℃，45 s），延伸（72 ℃，1 min），30個循環(huán)；總延伸（72 ℃，10 min）。純化回收目的片段，連接至pMD18-T載體，轉化大腸桿菌DH5α菌株，挑選陽性克隆進行雙向DNA測序。

表1 月月桂OsAACT基因克隆引物Table 1 Primers used for gene cloning of Osmanthus OsAACT

（3）3’-RACE擴增。使用SuperScriptTM II逆轉錄酶和包含oligo(dT)的Adapter Primer(AP)錨定引物合成cDNA第一鏈，再使用AACT3’gsp2/AACT3’gsp3引物分別與通用引物AUAP進行巢式PCR擴增，獲得目的基因cDNA 3’端序列。PCR擴增程序：預變性（94 ℃，5 min）；變性（94 ℃，30 s）、退火（56 ℃，45 s），延伸（72 ℃，1 min），35個循環(huán)；總延伸（72 ℃，10 min）。

（4）5’-RACE擴增。OligdT反轉錄后，按照Invitrogen RACE KIT說明書操作步驟，使用AACT5’gsp1和AAP引物合成cDNA第一鏈，再使用AACT5’gsp2/AACT5’gsp3引物分別與通用引物AUAP進行巢式PCR擴增，獲得目的基因5’端序列。PCR擴增程序：預變性（94 ℃，5 min）；變性（94 ℃，30 s）、退火（54 ℃，45 s），延伸（72 ℃，1 min），35個循環(huán)；總延伸（72 ℃，10 min）。

（5）生物信息學分析。使用ContigExpress對DNA測序結果進行拼接獲得完整序列，再通過 BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）進 行 序列比對。利用ExPASy ProtParam (http://cn.Expasy.org)程序與ScanProsite程序對月月桂AACT氨基酸殘基數(shù)目、氨基酸殘基組成比例、基因編碼蛋白質的分子量、理論等電點及親疏水性等性質進行預測和分析；利用SOPMA和GOR4程序預測月月桂AACT蛋白質的二級結構；利用Swissmodel(http://swissmodel.expasy.org/)程序，根據(jù)基因氨基酸序列，在PBD（Protein data bank, http://www.rcsb.org/pdb/home.do）數(shù)據(jù)庫搜索相似序列，采用alignment mode進行同源建模，預測OsAACT蛋白的三級結構；采用Clustal 2.0進行多序列匹配，使用Mega 5.0軟件的neighbor-joining（Kimura2-parameter）方法構建AACT基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 月月桂AACT基因全長cDNA的擴增

以月月桂花瓣的cDNA為模板，AACT-F和AACT-R為引物，擴增出一條749 bp的特異性片段，將此片段膠回收、轉化、測序，進行NCBI Blast比對分析，確定為月月桂AACT基因的保守片段；在此基礎上，利用特異性引物分別進行3’-RACE和5’-RACE，獲得月月桂AACT基因的3’端和5’端cDNA特異性片段（圖1）。將其回收、轉化、測序，經NCBI Blast比對分析確定為月月桂AACT的cDNA條帶。將上述3條月月桂AACT基因特異片段序列進行拼接，獲得了1條1580 bp的月月桂AACT全長cDNA序列。

圖1 OsAACT基因RT-PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agrose gel electrophoresis of RT-PCR amplif i cation of OsAACT

2.2 月月桂AACT的序列分析

通過BioEdit軟件分析發(fā)現(xiàn)，月月桂AACT的cDNA序列長為1 580 bp，開放閱讀框（open reading frame，ORF）在80～1 297 bp之間（圖2）。月月桂AACT的cDNA共編碼405個氨基酸；A+T含量較高，為55.76%；G+C含量較少為44.24%。

圖2 月月桂AACT全長cDNA及推導的氨基酸序列Fig.2 Full-length sequence of OsAACT cDNA and the deduced amino acid sequences

OsAACT氨基酸序列與假馬齒莧Bacopa monnieri(ACU875602)、 碧 桃Prunus persica(XP-007215468.1)、 煙 草Nicotiana tabacum(AAU95618.1)、 油 茶Camellia oleifera(ADD10719.1)、 長 春 花Catharanthus roseus(AEC13714.1)、浙江紅山茶Camellia chekiangoleosa(AGH32909.1)、 可 可Theobromacacao(XP-007049378.1)、 胡 黃 連Picrorohiza(ABC74567.1)、 橡 膠Hevea brasiliensis(BAF98276.1)、 羅 漢 果Siraitia grosvenorii(AEM42969.1)的AACT氨基酸序列相似性分別為 91%、87%、87%、89%、87%、89%、88%、90%、86%、86%。由圖3可知，AACT基因相對保守性，OsAACT與BmAACT/PhAACT 同源性較高，保守區(qū)集中在尾部和中上游。N端的變異性比較大，在中部也存在差異較大的區(qū)段，這些區(qū)段可能為基因進化提供一些參考依據(jù)。

由圖4進化樹分析可知，月月桂與胡黃連、假馬齒莧的親緣性最近，其次是長春花與煙草，與羅漢果的親緣性最遠。

圖3 月月桂AACT氨基酸序列的多重比對Fig.3 Multiple alignment of full length amino acid sequences of OsAACT

圖4 月月桂AACT同源基因系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of AACT homologous genes

2.3 月月桂AACT的蛋白質結構分析

月月桂AACT基因編碼的蛋白質中共有20種氨基酸，共計405個氨基酸，相對分子質量為41 347.89 D，等電點為5.66；蛋白質不穩(wěn)定系數(shù)為29.70，屬于穩(wěn)定蛋白，可靠性為3級。氨基酸含量最高的為Ala，為14.53 %；Gly、Leu、Val也較多，分別為12.07 %、9.85 %、9.61 %；含量最低的是Trp，為0.49 %。N端第一個氨基酸為Met。此蛋白的脂溶系數(shù)為100.27，疏水性平均值為0.215。采用Expasy Protscale程序詳細分析此編碼蛋白的疏水/親水性，蛋白質殘基中分別A374疏水性最強（2.989），A186親水性最強（-2.467），親水氨基酸的數(shù)量遠遠少于疏水氨基酸，因此推斷OsAACT蛋白為疏水性蛋白（見圖5）。

利用SOPMA和GOR4程序預測OsAACT二級結構（圖6）：該蛋白由46.91 %的α-螺旋、16.79 %的延伸鏈、14.07 %的b-轉角及22.22 %的無規(guī)則卷曲組成。α-螺旋是OsAACT中最多的結構元件，屬于混合型結構的蛋白質。CCD分析保守結構域可知（見圖7），OsAACT基因編碼的蛋白為多結構域蛋白，屬于Cond-enzymes超家族。

圖5 月月桂AACT蛋白的親水/疏水性預測Fig.5 Predictions of hydrophobicity and rophilicity of OsAACT proteins

圖6 月月桂AACT蛋白二級結構預測Fig.6 Prediction of secondary structure of the deduced OsAACT protein

圖7 月月桂AACT蛋白的保守結構域預測Fig.7 Prediction of conserved domains of the deduced OsAACT protein

以人線粒體乙酰CoA硫解酶 (2f2s.1.A)為模板，利用Swiss-Model對AACT蛋白同源建模（見圖8），推導的蛋白模型QMEAN4得分為0.76，與模板蛋白序列的相似性為52.47%

3 討 論

本研究通過RT-PCR同源克隆、3’-RACE、5’-RACE技術獲得月月桂AACT的全長cDNA序列，生物信息學分析結果表明，月月桂AACT開放閱讀框在80～1 297 bp之間，共編碼405個氨基酸，相對分子質量為41 347.89 D，等電點為5.66，為疏水性穩(wěn)定蛋白，屬Cond-enzymes超家族。氨基酸序列比對和進化樹分析都可以發(fā)現(xiàn)，AACT的保守性高。

圖8 月月桂AACT推導的蛋白三級結構Fig.8 Prediction of tertiary structure of the deduced OsAACT protein

AACT為動物、植物、酵母和真菌中膜甾醇的生物合成提供中間物。在真菌中合成聚3-羥丁酸化合物等碳化合物和能源儲存化合物。而且乙酰輔酶A?；D移妹能夠催化動物肝臟中酮體的生物合成，參與肝外組織酮體的降解。目前，關于AACT的研究主要傾向于二級代謝積累和非生物抗逆性，但其在植物中類異戊二烯生物合成的作用不是很清楚。擬南芥、鼠尾草、苜蓿屬等物種類異戊二烯合成途徑的報道表明，AACT具有重要的生物學功能，且呈現(xiàn)出多樣性。因此，AACT的基因研究具有很大的科學價值。本研究結果為下一步開展AACT基因在桂花萜類合成途徑中的調控規(guī)律研究提供基礎。

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Full length cloning and bioinformatics analysis of Acetyl-CoA C-acetyltransferase gene inOsmanthus fragrans

ZHENG Yu-juan1,2, ZHOU Wen-hua2, ZHANG Dang-quan1, CHEN Li-li1, CHEN Rong1, GONG Jian-ping3
(1. Human Provincial Key Lab. of Forestry Biotechnology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004,Hunan, China; 2. National Engineering Lab. for Rice and Byproducts Processing, Changsha 410004, Hunan, China; 3.Hunan Lixian Shuda Garden Co. Ltd., Lixian 415513, Hunan, China)

In order to clone and separate the gene of AACT inOsmanthus frangtans, and to study its genetic characteristics and protein structure, by taking RNA inO. frangransfl ower as template, AACT gene was isolated from fl owers ofO. frangransby the method of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and the rapid amplification of cDNA ends(RACE) technique. NCBI website and bio-informatics software were used to predict and analyze base distribution, amino acids composition, hydrophilicity or hydrophobicity, hyper-conservative region, secondary structure, and three-level structure. The results were used to compare with AACT amino acid sequences of other ten species and the related evolution analysis was conducted. The single chain of AACT gene was 1580 bp, code was made up of proteins containing amino acid of 405, and relative molecular mass of protein was 41 347.89 with Aar of 14.53.The isoelectric point was 5.66, and grand average of hydropathicity was 0.215. It belonged to the cond-enzymes superfamily. After many comparisons with other ten species, the amino acid sequences ofPicrorohizaandBacopa monnieriwere the highest. The gene of OsAACT was stable and coded albume was hydrophobic protein which was quite conservative in evolution. The information of gene gained in the test paved the way for the further study on synthetic of the terpenoid substances.

Osmanthus frangtans; Acetyl-CoA C-acetyltransferase; full length cDNA cloning; bioinformatics analysis

S759.95；Q781

A

1673-923X(2015)06-0087-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.06.016

2014-09-22

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201204610）；湖南省科技計劃重點項目（2014FJ2004）；湖南省教育廳一般項目（13C1168）

鄭玉娟，碩士研究生 通訊作者：張黨權，教授，博士生導師；E-mail：zhangdangquan@163.com

鄭玉娟,周文化,張黨權,等. 月月桂AACT基因的cDNA全長克隆及生物信息學分析[J].中南林業(yè)科技大學學報, 2015,35(6): 87-92.

[本文編校：吳 彬]