樟葉越桔糖基轉(zhuǎn)移酶VdUGT1基因克隆及序列分析

宋 健，熊 宏，朱東陽(yáng)，趙 平，杜 維，劉小燭，丁 勇

（1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

樟葉越桔糖基轉(zhuǎn)移酶VdUGT1基因克隆及序列分析

宋 健1，熊 宏1，朱東陽(yáng)2，趙 平2，杜 維1，劉小燭1，丁 勇1

（1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

根據(jù)樟葉越桔Vaccinium dunalianum葉芽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)獲得的糖基轉(zhuǎn)移酶VdUGT1基因部分cDNA序列設(shè)計(jì)引物，采用RACE-PCR技術(shù)克隆了全長(zhǎng)1 620 bp cDNA序列的VdUGT1基因，包括1 398 bp cDNA序列的完整開(kāi)放閱讀框，推測(cè)編碼由465個(gè)氨基酸殘基組成、相對(duì)分子質(zhì)量為50.89 kD的糖基轉(zhuǎn)移酶VdUGT1。序列分析表明，VdUGT1理論等電點(diǎn)為5.53，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為53個(gè)，正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為41個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為48.38，屬于不穩(wěn)定蛋白；其二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)件為α-螺旋和隨機(jī)卷曲，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于親水性蛋白質(zhì)。VdUGT1位于C末端含有尿嘧啶核苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶所特有UDPGT功能域，推測(cè)與尿嘧啶核苷二磷酸糖的結(jié)合有關(guān)。該研究為后期VdUGT1的異源表達(dá)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。

樟葉越桔；尿嘧啶核苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶；RACE；基因克??；序列分析

糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferases，GTs；EC 2.4.x.y）是所有生物有機(jī)體中存在的專門(mén)負(fù)責(zé)催化糖基化反應(yīng)的酶，它能將活性糖基從供體分子轉(zhuǎn)移到受體分子上[1]。植物中常見(jiàn)的糖基供體是尿嘧啶核苷二磷酸（Uridine diphosphate，UDP）糖（葡萄糖、半乳糖、木糖和鼠李糖等）[2-5]，因此GTs也被稱為尿嘧啶核苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferases，UGTs）。糖基化受體包括次級(jí)代謝產(chǎn)物、激素、病原菌侵染物、以及內(nèi)外源毒性物質(zhì)等植物小分子化合物[4-5]。糖基化是植物小分子化合物較普遍的一種修飾反應(yīng)，可以改變受體分子的化學(xué)穩(wěn)定性、親水性、轉(zhuǎn)運(yùn)性、亞細(xì)胞定位，有助于其在細(xì)胞內(nèi)和生物體內(nèi)的運(yùn)輸和貯藏[6]。UGTs具有多種生物活性與功能，可催化多種底物，其在植物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)、解除內(nèi)外源毒素毒性、以及次生代謝產(chǎn)物合成與貯存等方面發(fā)揮重要功能[7]。

樟葉越桔Vaccinium dunalianum為杜鵑花科Ericaceae越桔屬Vaccinium植物。Zhao[8]等發(fā)現(xiàn)云南省野生樟葉越桔是一種富含熊果苷（arbutin，對(duì)-羥基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷）及其衍生物的特殊資源植物。天然熊果苷是植物體內(nèi)的對(duì)苯二酚和UDP葡萄糖在UGTs成員之一熊果苷合成酶（arbutin synthase）（EC2.4.1.-）的催化下生物合成而來(lái)。推測(cè)樟葉越桔中存在高活性表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶VdUGT家族，并提示酶基因及其表達(dá)產(chǎn)物在該植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有某種重要的、不可或缺的生物學(xué)功能。

UGTs在擬南芥Arabidopsis thaliana[6]、蛇根木Rauwolf i a serpentina[9]、小立碗蘚Physcomitrella patens和 江 南 卷 柏Selaginella moellendorff i i[10]、山葡萄Vitis amurensis[11]、水稻Oryza sativassp.Japonica[12]、以及鷹嘴豆Cicer arietinum[13]等物種中都有一定的研究，所對(duì)應(yīng)的基因均已被克隆并測(cè)序。但目前尚無(wú)樟葉越桔糖基轉(zhuǎn)移酶及其基因的相關(guān)報(bào)道。本研究根據(jù)前期樟葉越桔葉芽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)得到的VdUGT1基因部分cDNA序列設(shè)計(jì)引物，結(jié)合RACE-PCR技術(shù)克隆了VdUGT1基因全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)VdUGT1蛋白特性進(jìn)行了分析。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

供試樟葉越桔Vaccinium dunalianumWight葉芽材料采自云南省楚雄彝族自治州武定縣高橋鎮(zhèn)唐家村（海拔2 100 m，北緯25°57′、東經(jīng)102°24′）。取樟葉越桔新鮮葉芽置于液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于–80℃冰箱中備用。

植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，RACE-PCR試劑盒購(gòu)自Clontech公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑和pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程有限公司，膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，其他相關(guān)試劑購(gòu)自昆明滇工科技有限公司，大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取與檢測(cè)

參照朱東陽(yáng)等[14]方法提取樟葉越桔葉芽總RNA，分別用紫外分光光度計(jì)法和1.2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)總RNA樣品的純度和完整性。

1.2.2 樟葉越桔VdUGT1基因全長(zhǎng)cDNA克隆

根據(jù)本課題組前期樟葉越桔葉芽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的VdUGT1基因部分cDNA序列設(shè)計(jì)RACE引物，引物合成由上海生物工程有限公司完成。3′-RACE引物包括反轉(zhuǎn)錄引物Adaptor-Oligo（dT）17：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGA GCTCAAGC（dT）17-3′，接頭外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物分別為 AP-Outer：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3′和 AP-Inner：5′-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3′，特異性外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物分別為3′-GS-Outer：5′-GCCCTTCTACCAAGTCCAG-3′和 3′-GSInner：5′-CACCCTCACCGTAAATCGC-3′，第一鏈cDNA合成按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。二輪PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

根據(jù)VdUGT1基因已知EST和3′RACEPCR克 隆 的3′末 端cDNA序 列， 設(shè) 計(jì)5′-RACE 特 異 性 巢 式 引 物 5′-GS-Outer：5′-CAAGAACCCGCCCGTACCCGT-3′和 5′-GSInner：5′-GAGGGTAGTTTGGGTATTGGACGG-3′，按照RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。第一輪Touchdown-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，78℃退火30 s，72℃延伸 2 min，8個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃；94℃變性30 s，70℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)。第二輪PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，70℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)、回收、T/A克隆與測(cè)序

PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，回收目的片段并連接到pMD18-T載體上，將重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)篩選白色菌落，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.4 VdUGT1的生物信息學(xué)分析

采用NCBI提供的ORF fi nder程序分析基因開(kāi)放閱讀框；DNAMAN構(gòu)建ORF核苷酸序列并推導(dǎo)其氨基酸序列；利用ExPASy ProtParam程序分析氨基酸的殘基數(shù)目與組成、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)和穩(wěn)定性；利用NCBI Blast程序?qū)ν茖?dǎo)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相似性比較，Clustalx2和Jalview軟件對(duì)同源性高的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，MEGA4.1分子進(jìn)化遺傳分析軟件通過(guò)鄰位相連法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，系統(tǒng)樹(shù)每個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析以自展法（Boot-strp）進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1 000次[15]；使用 Siganal V4.0 （http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP-2.0/）分析蛋白信號(hào)肽；使 用 TMHMM（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM） 和 Proscale（http://www.expasy.org/cgibin/protscale.pl）分別檢測(cè)其跨膜結(jié)構(gòu)和親水/疏水性特性；利用SOPMA程序（http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/ npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用NCBI提供 的 Conserved Domain Search （CD-Search） 服務(wù) 器（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白功能域分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟葉越桔VdUGT1基因cDNA全長(zhǎng)克隆

本實(shí)驗(yàn)獲得的樟葉越桔葉芽總RNA的28S和18S rRNA條帶清晰完整，亮度比約為2∶1，無(wú)彌散拖尾且點(diǎn)樣孔無(wú)污染，總RNA的A260/A280值處于1.8～2.0之間。以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行RACE-PCR擴(kuò)增，得到樟葉越桔VdUGT1基因3′末端cDNA和5′末端cDNA（圖1），經(jīng)回收主條帶、TA克隆測(cè)序長(zhǎng)度分別為1 315 bp和242 bp，最終拼接得到樟葉越桔VdUGT1基因全長(zhǎng)cDNA序列為1 620 bp。

圖1 樟葉越桔VdUGT1基因3’RACE（A）和5’ RACE（B）PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agrose gel electrophoresis analysis of VdUGT1 3’RACE (A) and 5’ RACE (B) PCR products

2.2 序列分析

克隆的樟葉越桔VdUGT1基因mRNA序列長(zhǎng) 1 620 bp，包括 57 bp 5′UTR、1 398 bp ORF 和165 bp 3′UTR，推測(cè)編碼由465個(gè)氨基酸組成的VdUGT1蛋白。VdUGT1基因ORF序列及其推導(dǎo)的蛋白序列如圖2所示。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示VdUGT1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為50.89 kD，氨基酸總數(shù)為465個(gè)，理論等電點(diǎn)為5.53，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為53個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為41個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為48.38，推測(cè)VdUGT1屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

圖2 VdUGT1 ORF核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of VdUGT1 ORF

同源性分析結(jié)果顯示VdUGT1與枸杞Lycium barbarum（LbUGT，AB360632.1）、 蛇 根 木R.Serpentine（RsUGT，AJ310148.1）、番茄Solanum lycopersicum（SlUGT，XM_004231159.1）等的糖基轉(zhuǎn)移酶之間具有48%～64%的序列同源性，其中與枸杞LbUGT和蛇根木RsUGT同源性分別高達(dá)64%和63%。類似于其他物種的糖基轉(zhuǎn)移酶，樟葉越桔VdUGT1位于C末端含有尿嘧啶核苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶所特有UDPGT功能結(jié)構(gòu)域PSPG box（圖3）。對(duì)圖3中顯示的不同物種的GTs進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，結(jié)果顯示樟葉越桔VdUGT1與 羅 漢 果SgUGT2（HQ259621.1） 和SgUGT3（HQ259622.1）聚為一分支（圖4）。

信號(hào)肽是分泌性蛋白N端的一段氨基酸序列，是指導(dǎo)分泌性蛋白合成的最重要因素，一般有16～26個(gè)氨基酸殘基，在完成自己的功能后被切除[16]。VdUGT1蛋白信號(hào)肽分析結(jié)果顯示，最大C值（原始剪切位點(diǎn)的分值）為0.144，位于第51個(gè)氨基酸殘基；最大Y值（綜合剪切位點(diǎn)的分值）為0.058，位于第46個(gè)氨基酸殘基；最大S值（信號(hào)肽的分值）為0.217，位于第10個(gè)氨基酸殘基；平均S值為0.102，位于第1～45位氨基酸殘基之間；綜合計(jì)算信號(hào)肽存在的可能性值為0.009，信號(hào)錨定的可能性值為0.001，第17～18位氨基酸殘基之間的剪切的值為0.004。推測(cè)樟葉越桔VdUGT1為非分泌性蛋白。蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5）顯示VdUGT1肽鏈不存在蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域，位于細(xì)胞膜外。

圖3 VdUGT1和其他植物GTs的氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Alignment of deduced amino acid sequences of VdUGT1 and GTs gene from other plants

圖4 VdUGT1和其他植物GTs的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic analysis of VdUGT1 and other plant GTs

疏水性一方面可以為二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果提供參考，另一方面還可以為結(jié)構(gòu)域以及功能域的劃分提供依據(jù)[17]。通過(guò)疏水性分析樟葉越桔VdUGT1蛋白質(zhì)中疏水性最大值是2.286, 位于第115位氨基酸殘基處；親水性最大值是-2.264，位于第189位氨基酸殘基處；綜合分析其親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中，沒(méi)有明顯的疏水區(qū)域（圖6）。結(jié)合蛋白質(zhì)性質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果，推測(cè)樟葉越桔VdUGT1為非分泌性的可溶性蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞質(zhì)中合成后不經(jīng)運(yùn)轉(zhuǎn)，直接分布在細(xì)胞質(zhì)特定部位發(fā)揮其功能。

圖5 VdUGT1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of transmembrane regions of VdUGT1

圖6 VdUGT1蛋白質(zhì)疏水性和親水性分析Fig.6 Prediction of VdUGT1 protein hydroPhobicity and hydroPhilicity prof i le

蛋白質(zhì)分子的多肽鏈通常折疊和盤(pán)曲成比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，形成比較穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步才能完成活性功能域構(gòu)象的構(gòu)建，以完成特定的生命活動(dòng)。VdUGT1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖7）顯示其由43.01%的α-螺旋、5.81%的β-轉(zhuǎn)角、14.19%的β-折疊和36.99%的隨機(jī)卷曲組成?？梢?jiàn)α-螺旋和隨機(jī)卷曲構(gòu)成了VdUGT1蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)。VdUGT1蛋白結(jié)構(gòu)功能域分析結(jié)果表明其含有PLN00164、PLN03015、UDPGT、MGT和COG1819等多種功能域，其中位于C末端含有尿嘧啶核苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶所特有UDPGT功能域，推測(cè)與尿嘧啶核苷二磷酸糖（UDP-sugar）的結(jié)合有關(guān)[18]。

圖7 VdUGT1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Secondary structure prediction of deduced VdUGT1 protein

3 結(jié) 論

GTs為高度分歧的多源基因家族，根據(jù)蛋白酶的催化特性、氨基酸序列相似性、以及有無(wú)保守結(jié)構(gòu)/功能域，目前已將其分為96個(gè)家族[19-20]。其中，糖基轉(zhuǎn)移酶家族1（GT1），又稱UGTs，是GTs中的最大家族[4-5]，可催化激素、類黃酮、以及像殺蟲(chóng)劑和除草劑等外源物質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物的糖基化[13]。目前已在擬南芥Arabidopsis thaliana中發(fā)現(xiàn)有120個(gè)UGTs基因[6]，在江南卷柏Selaginella moellendorff i i和小立碗蘚Physcomitrella patens中分別發(fā)現(xiàn)有142個(gè)和21個(gè)UGTs基因[10]，在‘黑比諾’Pinot Noir葡萄Vitis vinifera中發(fā)現(xiàn)有99個(gè)UGTs基因[21]，在水稻Oryza sativassp. Japonica中發(fā)現(xiàn)有213個(gè)UGTs基因[12]，在鷹嘴豆Cicer arietinum中發(fā)現(xiàn)有96個(gè)UGTs基因[13]，所對(duì)應(yīng)的基因全序列或部分序列已被克隆并測(cè)序。本課題組前期工作開(kāi)展了樟葉越桔葉芽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析研究，通過(guò)COG功能分類分析獲得了至少53條樟葉越桔糖基轉(zhuǎn)移酶基因EST序列。本研究通過(guò)RACE-PCR技術(shù)克隆了一個(gè)全長(zhǎng)1 620 bp mRNA序列的樟葉越桔糖基轉(zhuǎn)移酶基因，命名為VdUGT1，具有真核生物mRNA典型的Poly（A）尾巴結(jié)構(gòu)和完整的ORF區(qū)域。

氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同植物的已知UGTs在C末端均具有1個(gè)由44個(gè)氨基酸殘基組成的與底物供體UDP-sugar結(jié)合密切相關(guān)的高保守性的特征模體（signature motif），稱為PSPG模 體（Plant Secondary Product Glycosyltransferase Motif），推測(cè)與UDP-sugar的結(jié)合有關(guān)[19-20]。本研究克隆獲得的VdUGT1基因推測(cè)編碼的由465個(gè)氨基酸殘基組成的樟葉越桔糖基轉(zhuǎn)移酶VdUGT1在381-384位氨基酸殘基間同樣具有UGTs特征模體—PSPG模體（圖3），保守序列為WAPQIEVLSHGSTGGFLSHCGWNSTIESVVH GVPIIAWPLYA EQ，決定了糖基供體結(jié)合位點(diǎn)的微環(huán)境。另外，在VdUGT1蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域（N-Terminal Domain，NTD）第18位（圖3）有1個(gè)保守的組氨酸殘基，推測(cè)與存在于其他植物UGTs的NTD中的保守的組氨酸殘基一樣，可提供堿性微環(huán)境（如OH和NH等），對(duì)糖基供體和受體分子之間的結(jié)合起催化作用，有助于糖基受體去質(zhì)子化，接受來(lái)自于糖基供體分子上的末端異構(gòu)中心的親核攻擊，這也是UGTs催化糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的基礎(chǔ)[13,22]。

UGTs的亞細(xì)胞定位研究表明，UGTs一般為可溶性蛋白質(zhì)[3]。在植物細(xì)胞中不同組分的UGTs活性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)證明，絕大多數(shù)UGTs是在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中才表現(xiàn)出活性[23-24]。本研究根據(jù)蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)和跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果推測(cè)樟葉越桔VdUGT1為非分泌性的可溶性蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞質(zhì)中合成后不經(jīng)運(yùn)轉(zhuǎn)，直接分布在細(xì)胞基質(zhì)特定部位發(fā)揮其功能。不同種類的UGTs可能定位于不同細(xì)胞或同一細(xì)胞的不同細(xì)胞器，以催化不同底物的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)[22]。Hefner等[9]研究表明在74種天然或合成化合物中，有45個(gè)化合物可以被蛇根木糖基轉(zhuǎn)移酶RsUGT糖基化，表明UGTs的底物專一性較低。UDPG和對(duì)苯二酚在植物體內(nèi)可被UGTs成員之一熊果苷合成酶催化生成熊果苷，因其能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素的形成，熊果苷被國(guó)際公認(rèn)為21世紀(jì)天然、低毒、高效的皮膚美白劑，是皮膚美白化妝品中理想的活性添加成分。本課題組Zhao等[8]研究發(fā)現(xiàn)在樟葉越桔幼嫩葉芽中熊果苷衍生物含量占植物材料干重的22%，推測(cè)在樟葉越桔中存在高活性表達(dá)的UGTs。本研究成功從樟葉越桔中分離得到糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族中的VdUGT1基因全長(zhǎng)cDNA序列，推導(dǎo)的糖基轉(zhuǎn)移酶VdUGT1屬于UGTs家族的一個(gè)新成員。VdUGT1是否具有與其他UGTs類似的多底物接受特性，則需要開(kāi)展異源表達(dá)和功能驗(yàn)證等深入研究。

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Cloning and sequence analysis of Glycosyltransferase geneVdUGT1 inVaccinium dunalianum

SONG Jian1, XIONG Hong1, ZHU Dong-yang2, ZHAO Ping2, DU Wei1, LIU Xiao-zhi1, DING Yong1
(1. College of Life Sciences, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2. Key Lab. for Forest Resources Conservation and Use in Southwest Mountains of China, Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

Based on the partial cDNA of geneVdUGT1 isolated by transcriptome sequencing fromV. dunalianumin previous study,the full-length cDNA comprised 1 620 nucleotides consisting of an open reading frame of 1398 nucleotides was cloned by RACE-PCR fromV. dunalianum. The open reading frame encoded a putative VdUGT1 comprising 465 amino acid residues with molecular weight of 50.89 kD and isoelectric point of 5.53. The sequence analysis showed that the total numbers of negative charged residues (Asp+Glu) and charged residues (Arg+Lys) in VdUGT1 were 53 and 41, respectively. VdUGT1 with unstable coeff i cient 48.38 belongs to the unstable protein. It was predictive VdUGT1 had no signal peptide and transmembrane structure. The main parts of predicted secondary structures of VdUGT1 were α-helices and random coils. UDPGT domain, a characteristic functional domain of UDP-glycosyl- transferases existing in the near C-terminus of VdUGT1 plays an important role in combining with UDP-sugar. The results established a foundation for the heterologous expression and functional analysis of VdUGT1in the later period.

Vaccinium dunalianum; UDP-glycosyltransferase; RACE; gene cloning; sequence analysis

S759.95；S663.9

A

1673-923X(2015)06-0080-07

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.06.015

2014-12-03

云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目；云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（50097505）；國(guó)家自然科學(xué)基金（21462040, 31460076）

宋 健，碩士研究生 通訊作者：丁 勇，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：dingyong@swfu.edu.cn

宋 健,熊 宏,朱東陽(yáng),等. 樟葉越桔糖基轉(zhuǎn)移酶VdUGT1基因克隆及序列分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 35(6):80-86.

[本文編校：吳 彬]