多發(fā)性肌炎并肺間質(zhì)病變血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究

李秋蘭，章 濤，洪文婷，林夏鴻，林 玲，陳小青

多發(fā)性肌炎（polymyositis，PM）是以累及橫紋肌為特征的結(jié)締組織病，常合并肺間質(zhì)病變（interstitial lung disease，ILD），嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確。筆者科室于2011年11月—2013年11月收治部分PM及PM＋I(xiàn)LD患者，通過(guò)雙向電泳與質(zhì)譜分析患者血清中表達(dá)的差異蛋白，并與正常人群比較，探討PM的發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 PM患者3例，男性1例，女性2例，年齡分別為45，48，39歲。PM＋I(xiàn)LD患者3例，男性1例，女性2例，年齡分別為50，46，44歲?；颊呔螧ohan和Peter的PM診斷標(biāo)準(zhǔn)，并行肺部薄層CT檢查判斷是否伴發(fā)ILD。另外收集正常對(duì)照組3例，男性1例，女性2例，年齡分別為43，46，48歲。

1.2 方法

1.2.1 試劑 BCA蛋白定量試劑盒（編號(hào)：AR0146，中國(guó)碧云天公司）；IPG 預(yù)制膠條（PH3－10，24cm）、3－[（3－膽酞胺醛）－二乙胺1－丙磺]、二硫蘇糖醇、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、尿素、考馬斯亮藍(lán)R350、碘乙酰胺等（美國(guó)GE公司）；甘氨酸、低熔點(diǎn)瓊脂糖、N，N’－甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺、Tris堿、溴酚藍(lán)等（美國(guó)Sigma公司）；人微量轉(zhuǎn)鐵蛋白（MTF）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（美國(guó)R ＆ D公司）。

1.2.2 儀器 等電聚焦系統(tǒng)（Ettan IPGphor III）、垂直 電 泳 系 統(tǒng) （ESP601、Multi Temp Ⅳ）、Image Master 2D分析系統(tǒng)（Platinum 7.0）、掃描儀（美國(guó)GE公司）；多功能酶標(biāo)儀（Sunrise，德國(guó)Tecan公司）。

1.2.3 測(cè)定生化指標(biāo) 總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）等采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)（CX－5型，美國(guó)Beckman公司）。

1.2.4 采集與制備標(biāo)本 每例患者取靜脈血6mL，室 溫 下 放 置 20min，3 000r／min 離 心15min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算所需的血清量，保證每個(gè)樣本含等量蛋白。分別將PM、PM＋I(xiàn)LD、對(duì)照組3組血清池混制，并分裝成3管，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 雙向凝膠電泳 將3組血清在相同參數(shù)條件下進(jìn)行平行雙向電泳，電泳凝膠用考馬斯亮蘭染色。染色后的雙向電泳凝膠圖像用掃描儀掃入電腦，經(jīng)Image Master系統(tǒng)分析凝膠圖像。3組的凝膠圖譜進(jìn)行匹配比對(duì)分析。設(shè)置平滑（smooth＝10）、顯著值（saliency＝2）、最小區(qū)域（min area＝5）等參數(shù)進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)，設(shè)置landmark蛋白點(diǎn)后進(jìn)行匹配。數(shù)據(jù)分析后選取光密度差異（ratio）＞2且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的蛋白質(zhì)點(diǎn)為差異表達(dá)的蛋白。

1.2.6 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI－TOF－MS）） 挖取有明顯差異的蛋白點(diǎn)凝膠送昆明賽金公司進(jìn)行MALDI－TOF－MS分析。利用Mascot搜索引擎，進(jìn)行MS／MS離子搜索；對(duì)獲得的肽指紋在SwissProt和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，分析鑒定蛋白。

1.2.7 ELISA方法驗(yàn)證 擴(kuò)大樣本的例數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，共收集PM 或皮肌炎（dermatomyositis，DM））組30例（其中PM患者13例、DM 患者17例）、PM＋I(xiàn)LD組6例、DM＋I(xiàn)LD組8例、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）組18例、正常對(duì)照組15例，用ELISA方法進(jìn)行驗(yàn)證。SLE組為疾病對(duì)照組，滿(mǎn)足無(wú)合并肺間質(zhì)疾病，無(wú)發(fā)生感染，無(wú)合并惡性腫瘤等因素，SLE的診斷符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）修訂的SLE分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對(duì)于顯著偏態(tài)分布的資料的組間比較采用Mann－WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清蛋白質(zhì)組的蛋白點(diǎn)差異分析 將PM、PM＋I(xiàn)LD、對(duì)照組的混合血清在同等條件下重復(fù)進(jìn)行3次雙向電泳，獲得3組蛋白圖譜。其中PM組3張圖找到的蛋白質(zhì)點(diǎn)為（252±11）個(gè)，匹配率平均為78.00%；PM＋I(xiàn)LD組找到的蛋白質(zhì)點(diǎn)（235±8）個(gè)，匹配率平均為80.305%；對(duì)照組找到的蛋白質(zhì)點(diǎn)為（239±7）個(gè)，匹配率平均為79.160%。3組的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行組間比較：與對(duì)照組比較，PM組和PM＋I(xiàn)LD組同時(shí)表達(dá)且表達(dá)上調(diào)的差異蛋白點(diǎn)有20個(gè)、表達(dá)下調(diào)的4個(gè)；與PM組比較，PM＋I(xiàn)LD組表達(dá)上調(diào)的差異蛋白點(diǎn)有2個(gè)，表達(dá)下調(diào)的7個(gè)（表1）。對(duì)3組的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行兩兩比較，有15個(gè)明顯差異蛋白點(diǎn)（表2）。3組各取一張蛋白質(zhì)組的雙向電泳圖譜（圖1）。

2.2 質(zhì)譜鑒定 挖取15個(gè)差異明顯的蛋白點(diǎn)凝膠送檢，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定出9種蛋白：（1）與對(duì)照組比較，PM組有4個(gè)差異蛋白表達(dá)上調(diào)，1個(gè)差異蛋白表達(dá)下調(diào)，表達(dá)上調(diào)的差異蛋白成功鑒定為血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A protein，SAA）、載脂蛋白 A1（apolipoprotein A－1，apoA－1）、凝 集 素（clusterin，CLU）、血清白蛋白（serum albumin，ALB）；表達(dá)下調(diào)的差異蛋白鑒定為轉(zhuǎn)鐵蛋白（serotransferrin，TRF）。PM＋I(xiàn)LD組有4個(gè)差異蛋白同時(shí)表達(dá)下調(diào)，成功鑒定為 TRF、鋅－a2－糖蛋白（zinc－alpha－2－glycoprotein，ZAG）、a2－H2－糖 蛋 白（alpha－2－HS－glycoprotein，AHSG）、a1－β－糖 蛋 白（alpha－1B－glycoprotein，A1BG）。（2）與 PM 組比較，PM＋I(xiàn)LD組的2個(gè)差異蛋白同時(shí)表達(dá)下調(diào)，鑒定為β2－糖蛋白1（beta－2－glycoprotein 1，β2－GP1）和TRF。成功鑒定出的差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 PM組、PM＋I(xiàn)LD組及對(duì)照組同時(shí)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)Tab 1 Differential espressed protein in PM，PM＋I(xiàn)LD and HD

表2 PM組、PM＋I(xiàn)LD組及對(duì)照組比較表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)Tab 2 Differential espressed protein among PM，PM＋I(xiàn)LD and HD

2.3 生化指標(biāo)比較 PM與PM＋I(xiàn)LD組患者的TC與TG水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），且PM＋I(xiàn)LD組 TC水平高于PM 組（P＜0.05），而TG水平在2組間比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表4）。

圖1 PM組、PM＋I(xiàn)LD組及對(duì)照組的雙向電泳圖Fig 1 Gels figure of PM，PM＋I(xiàn)LD and HD

表3 成功鑒定的蛋白質(zhì)質(zhì)譜結(jié)果Tab 3 The success of protein mass spectrometry identification results

表4 PM、PM＋I(xiàn)LD與對(duì)照組的TC、TG比較Tab 4 TC，TG of PM，PM＋I(xiàn)LD and HD mmol／L

2.4 TRF在組間的比較 TRF的血清濃度在PM、DM、PM＋I(xiàn)LD、SLE、對(duì)照組各組間比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表5）。

表5 TRF在PM、PM＋I(xiàn)LD、SLE和對(duì)照組間的比較Tab 5 TRF of PM，DM，PM＋I(xiàn)LD，SLE and HD

3 討 論

現(xiàn)有的研究提示，免疫機(jī)制（包括細(xì)胞免疫和體液免疫）和非免疫機(jī)制均與肌炎患者肌纖維損傷和肌肉功能障礙有關(guān)，但是不同機(jī)制的具體作用及機(jī)制間是否有交叉作用，目前皆不清楚。蛋白質(zhì)組學(xué)可應(yīng)用于探索復(fù)雜疾病的致病機(jī)制及尋找疾病診斷分子標(biāo)記蛋白，目前國(guó)外開(kāi)始嘗試將其用于特發(fā)性炎癥性肌病的研究[1]。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)PM組、PM＋I(xiàn)LD組與對(duì)照組的血清進(jìn)行分析，成功鑒定出9種蛋白質(zhì)，以下對(duì)它們可能發(fā)揮的功能進(jìn)行討論：

3.1 可能參與PM發(fā)病進(jìn)程的蛋白 SAA作為載脂蛋白家族中的高度異質(zhì)類(lèi)蛋白，是一種非常敏感的急性時(shí)相反應(yīng)物[2－3]，也是監(jiān)測(cè)炎癥（包括 DM）的指標(biāo)[4－6]。SAA 的前體即淀粉樣原纖維（AA）對(duì)PM患者血管的基底膜、細(xì)胞、細(xì)胞器膜、核膜進(jìn)行細(xì)胞毒性作用[7]，促使PM的血管內(nèi)皮增厚、基底膜改變及血管增殖等，造成皮膚損害與ILD。CLU是一種硫化二聚體糖蛋白，具有組織損傷后重建、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞粘附、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)補(bǔ)體活化等功能[8]。PM是一種自身免疫性疾病，可產(chǎn)生多種抗體[9]。CLU作為補(bǔ)體溶解抑制物，與 C5b－9相作用，使免疫復(fù)合物喪失活性，阻止抗體依賴(lài)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解及炎癥反應(yīng)[10－11]，從而限制補(bǔ)體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。另外，細(xì)胞內(nèi)CLU是新一代的惰性細(xì)胞毒素的變體，參與慢性?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[12]，造成肌肉缺氧、損傷。CLU起保護(hù)機(jī)制因素還是致病性因素，值得進(jìn)一步研究。

apoA－1是一種負(fù)急性時(shí)相蛋白，可抑制炎癥過(guò)程多個(gè)環(huán)節(jié)，起抗炎癥保護(hù)作用[13]。ALB在一定程度上反應(yīng)體內(nèi)炎癥反應(yīng)程度和患者一般消耗狀態(tài)[14]。低白蛋白癥是PM預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是PM合并ILD的預(yù)測(cè)因子[15]。在本次研究中，apoA－1、ALB對(duì)PM組患者可能起的是反饋性保護(hù)功能。

β2－GP1是一種單鏈糖蛋白。脂多糖和β2－GP1是對(duì)相互作用的蛋白，二者特異性結(jié)合后依賴(lài)Toll樣受體4信號(hào)傳導(dǎo)通路激活巨噬細(xì)胞的NF－κB[16]。持續(xù)激活 NF－κB可釋放大量炎癥因子[17－18]，引發(fā)細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。β2－GP1可能參與了PM的炎癥與損傷肌細(xì)胞的過(guò)程。

3.2 可能參與PM＋I(xiàn)LD發(fā)病進(jìn)程的蛋白 ZAG是一種分泌性蛋白，參與癌性惡病質(zhì)的形成[19]。主要通過(guò)促進(jìn)機(jī)體脂肪分解和增加產(chǎn)熱雙重途徑來(lái)減少體內(nèi)脂肪。當(dāng)小鼠患MAC16腫瘤后其ZAG分泌明顯增高，表現(xiàn)出明顯惡病質(zhì)，體質(zhì)量下降，同時(shí)脂肪含量顯著減少。本研究回顧性分析PM及PM＋I(xiàn)LD組患者的生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，2組患者的TC與TG水平均明顯高于對(duì)照組，且PM＋I(xiàn)LD組TC水平高于PM組。在本研究中，ZAG表達(dá)水平PM＋I(xiàn)LD組低于PM組。故推測(cè)PM合并ILD后使ZAG產(chǎn)生減少，同時(shí)也降低合并惡性腫瘤的可能性，與國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于PM或DM合并惡性腫瘤時(shí)再發(fā)生ILD的現(xiàn)象相對(duì)少見(jiàn)的報(bào)道一致[20]。

AHSG是一種負(fù)急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，可通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞激活及炎癥因子的釋放達(dá)到抗炎癥的作用[21－22]。AHSG 表 達(dá) 水 平 PM＋I(xiàn)LD 組 低 于 PM組，提示由于AHSG的降低使得PM＋I(xiàn)LD組患者體內(nèi)炎癥細(xì)胞激活及炎癥因子釋放的抑制作用減弱，加速I(mǎi)LD的進(jìn)程。

A1BG是一種酸性球蛋白，在肺癌、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病發(fā)現(xiàn)過(guò)該蛋白，具體功能未知[23－24]。A1BG可能參與了PM＋I(xiàn)LD的進(jìn)展，或是疾病的一種伴發(fā)現(xiàn)象。

3.3 可能參與PM及PM＋I(xiàn)LD疾病進(jìn)展的蛋白

氧化應(yīng)激參與了肺泡上皮細(xì)胞損傷和纖維化，氧化應(yīng)激水平明顯升高時(shí)，抗氧化物明顯降低。當(dāng)氧化與抗氧化失衡時(shí)，肺纖維化發(fā)生更為顯著[25－26]。TRF是一種體內(nèi)常見(jiàn)的抗氧化物質(zhì)。在本次研究中，蛋白組學(xué)的TRF表達(dá)水平為PM＋I(xiàn)LD組＜PM組＜對(duì)照組，提示TRF可能參與PM和PM＋I(xiàn)LD疾病的進(jìn)展。但筆者對(duì)PM或DM組、PM或DM＋I(xiàn)LD組、SLE組、對(duì)照組用ELISA方法進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行組間比較，TRF在上述各組間差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明TRF與PM及PM＋I(xiàn)LD疾病可能無(wú)關(guān)，原因可能是樣本例數(shù)不足，有待擴(kuò)大樣本量再行驗(yàn)證。

目前，2－DE分離蛋白質(zhì)仍存在一定的局限性[27]，主要是對(duì)低豐度蛋白質(zhì)、疏水性蛋白、極度酸性或堿性蛋白、極高或極低相對(duì)分子質(zhì)量等蛋白不能進(jìn)行有效分離，尤其是外周血清蛋白質(zhì)數(shù)量多，來(lái)源廣，蛋白質(zhì)差別大，都在一定程度上限制蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

綜上所述，TRF與PM及PM＋I(xiàn)LD疾病的進(jìn)展可能無(wú)關(guān)，而另8種蛋白SAA、CLU、ALB、apoA－1、ZAG、AHSG、A1BG、β2－GP1等為進(jìn)一步深入研究PM及PM＋I(xiàn)LD的致病機(jī)制提供了方向，但它們?nèi)绾螀⑴c疾病的進(jìn)程和具體的作用，以及是否所有的PM＋I(xiàn)LD、PM病例都存在相同的差異表達(dá)蛋白，仍然需要大樣本的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步明確。

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