七氟烷對糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能下降老年大鼠海馬谷氨酸和γ－氨基丁酸的影響

鄭曉春，吳桂壽，2，涂文劭，胡 彬，沈石文

2.三明市第二醫(yī)院 麻醉科，永安 366000；

3.福建醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)和工程學(xué)院，福州 350004

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）可引起體內(nèi)復(fù)雜的代謝機制紊亂，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性、進(jìn)展性并發(fā)癥對認(rèn)知功能產(chǎn)生影響[1]，被稱為DM相關(guān)認(rèn)知 降 低 （diabetes－associated cognitive decline，DACD），表現(xiàn)為空間執(zhí)行功能、學(xué)習(xí)和記憶能力受損[2－3]，DM 患者發(fā)生 DACD的風(fēng)險是正常人的1.5倍以上[4]。吸入麻醉劑七氟烷可導(dǎo)致一定程度的術(shù)后認(rèn)知功能障礙[5－6]。本研究觀察七氟烷對DACD老年大鼠認(rèn)知功能的影響和海馬神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸（glutamic acid，Glu）和γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）含量的改變，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康SD大鼠63只，月齡20月，體質(zhì)量300～400g[福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SYXK（閩）2012－0002]，雌雄不限。室溫（22±2）℃，濕度50%，明暗各12h，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d。通過Morris水迷宮訓(xùn)練并達(dá)到“學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)”（連續(xù)20次測試中≥18次正確）[7]。

分組：隨機分3組（n＝21）：（1）空白對照組（C組）：普通飼料喂養(yǎng)并排除 DM；（2）DACD 組（D組）：DM＋認(rèn)知功能下降組；（3）DACD＋七氟烷組（DS組）：在D組的基礎(chǔ)上吸入3%七氟烷，余2組吸入100%氧，時長分別為1，2，3h（n＝7）。

1.2 試劑與儀器 七氟烷（250mL，美國Baxter公司），由蒸發(fā)器設(shè)定輸出濃度，載體為O2（100%）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國Sigma公司），用0.1mol／L 的 檸 檬 酸 緩 沖 液 配 成1%，以25mg／kg腹腔注射。七氟烷揮發(fā)罐（美國Abbott公司）；麻醉機（美國Ohmeda公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1100，美國安捷倫公司）；Morris水迷宮（中國晟昌公司）；精密電子分析天平（BP21ID，美國Sartorius公司）；多功能監(jiān)護(hù)儀（MP60，荷蘭Philips公司）；有機玻璃方倉（0.4m×0.4m×0.6m，自制）。

1.3 方法

1.3.1 DM 模型的制備和鑒定 參照文獻(xiàn)[8]，大鼠高糖高脂飼料（10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%普通鼠飼料）喂養(yǎng)至第4周末，禁食12h，腹腔緩慢注射1%STZ，第3d測空腹血糖，如＞16.7mmol／L則認(rèn)定為模型建立。

1.3.2 水迷宮測試評估學(xué)習(xí)和記憶能力 參照文獻(xiàn)[3]，DM老年大鼠飼料不變，繼續(xù)飼養(yǎng)至第16周末。Morris水迷宮水池直徑1.8m，水深0.35m，水溫（24±2）℃。水下平臺直徑0.1m，高0.3m，水中加入脫脂奶粉使之不可見。攝像機記錄動物位置、運行速度和運動軌跡。實驗第1～4d為定位航行試驗（學(xué)習(xí)功能），每天將大鼠分別從4個象限面向池壁置入水中3次，記錄入水至找到站臺的時間為逃避潛伏期。第1d為游泳訓(xùn)練，若2min內(nèi)未找到站臺，則將大鼠引導(dǎo)至站臺，逃避潛伏期記為2min，檢測完成后取第2～4d逃避潛伏期的平均值。第5d為空間探索實驗（記憶功能），去除站臺，所有大鼠從固定位置面向池壁置入水中，記錄其在2min內(nèi)在各象限內(nèi)的游泳時間，計算在站臺所在象限游泳時間占4個象限游泳時間的百分比（Tp／T）。全部實驗結(jié)束后第6d復(fù)查Morris水迷宮，觀察實驗后的記憶能力改變。

1.3.3 七氟烷吸入 麻醉機氣體流量計控制氧氣流量3L／min，七氟烷蒸發(fā)罐控制輸出濃度3%，多功能監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測方倉內(nèi)七氟烷濃度和大鼠脈搏氧飽和度（SpO2），若SpO2＜97%立即移出方倉脫離麻醉劑吸氧，SpO2＞99%再重新開始實驗。

1.3.4 海馬Glu及GABA含量測定 參照文獻(xiàn)[9－11]，大鼠處死后快速斷頭剝離海馬，電子天平稱質(zhì)量（精確到0.1mg），加入2mL甲醇勻漿后取1mL離心，1 500r／min×5min。取上清100μL，加入衍生化試劑100μL，震蕩混勻反應(yīng)2min后，取100μL測定Glu和GABA含量。衍生化試劑：20.01mg鄰苯二甲醛，超聲溶于500μL甲醇，加入500μLβ－巰基乙醇和9mL硼砂緩沖液（pH＝10.0）。色譜柱：Eclipse XDB C18（4.6mm×150mm，5μm）。流動相：A 液為 0.1mol／L Na2HPO4·12H2O－NaH2PO4·2H2O 緩 沖 液（pH＝6.8）；B液為甲醇；A液／B液＝6∶4。檢測波長：激發(fā)光波長345nm，發(fā)射光波長455nm，流速1mL／min，柱溫25℃，進(jìn)樣5μL。將各氨基酸同內(nèi)標(biāo)的峰面積比值和各自濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定含內(nèi)標(biāo)樣品的待測氨基酸與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，求出樣品中2種氨基酸濃度。

Glu和 GABA含量（μg／g）＝[樣品濃度（μg／mL）×樣品溶解體積（mL）]／樣品重量（g）

2 結(jié) 果

2.1 空腹血糖的變化 3組血糖基礎(chǔ)值（0周）無差異，C組正常飼養(yǎng)16周內(nèi)空腹血糖均正常，排除DM。D組、DS組高糖高脂飼養(yǎng)4周后體型肥碩，與C組比較，血糖增高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＜0.05）；注射STZ后至16周均出現(xiàn)拒食、體型瘦弱，與4周時比較，血糖均顯著增高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），D組和DS組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 3組大鼠16周內(nèi)空腹血糖的比較Tab 1 Fasting blood glucose mmol／L

2.2 水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力 D組、DS組均出現(xiàn)逃避潛伏期延長、Tp／T百分比降低，與C組比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示學(xué)習(xí)和記憶能力均下降。DS組吸入七氟烷后逃避潛伏期延長、Tp／T百分比下降更明顯，與C、D組比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；吸入3h改變幅度加劇，與吸入1，2h比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示七氟烷對DACD老年大鼠的認(rèn)知能力進(jìn)一步降低，且和時間相關(guān)（表2）。

2.3 海馬Glu和GABA含量 D組和DS組Glu含量下降，GABA含量上升，Glu／GABA比值降低，與C組比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；隨著氣體吸入時間的增加，DS組的Glu含量明顯下降，GABA含量明顯上升，Glu／GABA比值明顯降低，與D組比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），吸入3h后的比值僅為1h時的1／2，組內(nèi)比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，表3）。

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)后DM大鼠的學(xué)習(xí)能力明顯減退，持續(xù)高血糖可以導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[12]，證實了在STZ誘導(dǎo)的DM大鼠模型上這是一個危險因素。研究發(fā)現(xiàn)，DM至少存在某些方面的認(rèn)知功能障礙，特別是空間執(zhí)行功能、學(xué)習(xí)、記憶能力受損[2－3]。本研究以高糖高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ建立了DM模型。Morris水迷宮實驗是研究動物空間學(xué)習(xí)和記憶功能的經(jīng)典方法，其中逃避潛伏期可客觀反應(yīng)大鼠的學(xué)習(xí)能力，而Tp／T可反映大鼠的記憶能力。DACD大鼠逃避潛伏期明顯延長，Tp／T百分比明顯降低[13]。本實驗通過水迷宮測試篩選出DACD老年大鼠模型。

表2 大鼠逃避潛伏期和Tp／T的比較Tab 2 Escape latency and raito of Tp／T

表3 3組大鼠海馬Glu、GABA含量及Glu／GABA比值的比較Tab 3 The contents of Glu and GABA and the raito of Glu／GABA in hippocampus

七氟烷是目前臨床常用的吸入麻醉劑，3%的七氟烷反復(fù)吸入可導(dǎo)致老年大鼠一過性的認(rèn)知功能障礙[5－6]。DACD老年人麻醉前已有認(rèn)知功能降低，但不同的七氟烷吸入濃度和吸入時間對其記憶能力及中樞神經(jīng)遞質(zhì)的影響尚不明確。有研究測定大鼠七氟烷的肺泡最低有效濃度（mininal alveolar concentration，MAC）為2.4%[14]，其ED99是1.3MAC，即3.12%。因此本研究中選取七氟烷的濃度為3%，以吸入1，2和3h模擬臨床中不同的麻醉時長。

海馬作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中邊緣系統(tǒng)的一部分，和學(xué)習(xí)、記憶以及空間定位功能密切相關(guān)，是影響記憶形成的重要部位，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及其縫隙連接都參與其中[15]。Glu和GABA作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有代表性的一對興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，也分布于海馬記憶形成的通路上，影響著記憶的形成。研究表明，學(xué)習(xí)記憶功能與長時程增強作用（long－term potentiation，LTP）有關(guān)，其主要依賴于NMDA受體[7]。Glu與NMDA受體結(jié)合時，可開放Ca2＋通道或Na＋通道，形成興奮性突觸后電位，出現(xiàn)長時程增強，從而提高學(xué)習(xí)記憶功能；同時，GABA可致C1—內(nèi)流，抑制長時程增強的形成，從而降低學(xué)習(xí)記憶功能。因此，興奮性Glu水平降低、抑制性GABA水平升高、Glu／GABA比值降低會導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能降低。本研究中DACD大鼠Glu、GABA與空白對照組差異不大，但七氟烷組Glu下降明顯，GABA顯著上升，Glu／GABA比值下降，其中吸入3h后變化更大，Morris水迷宮測試也證實了其記憶能力下降，提示七氟烷影響海馬突觸中興奮性－抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的平衡，進(jìn)一步抑制DACD老年大鼠的認(rèn)知功能。Irifune等也認(rèn)為，麻醉藥物主要是通過興奮或抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同位點的突觸通路而產(chǎn)生效應(yīng)，對突觸傳遞的抑制是全身麻醉的共同特性，直接或間接受體功能的抑制已被推測為麻醉作用的最后共同通路[16]。

綜上所述，長時間1.3MAC七氟烷吸入麻醉可進(jìn)一步降低DM相關(guān)認(rèn)知下降大鼠的記憶能力，其機制可能與七氟烷改變Glu和GABA平衡有關(guān)。

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