成年大鼠腦透析液和血清中褪黑素含量的測定

孟 濤，鄭志竑，葉 婧，林 玲

2.中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所 化學(xué)污染與健康安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

褪黑素（melatonin，MLT）主要是由松果體分泌的一種吲哚類激素，具有明顯的晝夜節(jié)律性，分泌高峰在夜間，白天分泌減少，且合成與分泌受光／暗周期信號、神經(jīng)系統(tǒng)等因素的調(diào)節(jié)[1－2]。松果體分泌MLT后立即釋放入腦脊液和血液，并與廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周組織器官靶細(xì)胞膜上的MLT受體相結(jié)合，參與機(jī)體的生長、發(fā)育、成熟和衰老等生命過程。既往的研究主要針對MLT功能以及血清和松果體MLT含量變化；近年來，研究者開始關(guān)注腦脊液中MLT的動態(tài)變化、腦內(nèi)MLT與血清MLT的相關(guān)性。本研究以正常成年大鼠為研究對象，將引導(dǎo)管置入前腦紋狀體內(nèi)，采用腦微透析技術(shù)動態(tài)收集透析液樣本，并采集大鼠尾靜脈血；用高效液相色譜（high－performance liquid chromatography，HPLC）－熒光法測定大鼠體內(nèi)的MLT，并分析腦透析液與血清中MLT之間的相關(guān)性；同時(shí)用酶聯(lián)免疫法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清中MLT含量，比較2種檢測方法的一致性，為進(jìn)一步了解體內(nèi)MLT的分泌模式、MLT含量的測定提供一種更為合理、有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量為（200±20）g[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司，許可證號：SCXK（滬 ）2007－0005]。 大 鼠 在 （23±2）℃、30%～45%濕度下置于無菌層流架內(nèi)飼養(yǎng)，光暗周期12h／12h，自由飲食飲水。

1.1.2 試劑 ELISA試劑盒（美國Uscnk公司）；MLT標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司）；甲醇和三氯甲烷（德國Merck公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore超純水；其他均為國產(chǎn)試劑。

1.1.3 儀器 大鼠腦立體定位儀（SR－5M，日本Narishige公司）；微透析探針及腦微透析系統(tǒng)（CMA12，瑞士CMA 公司），探針外徑0.5mm、膜長4mm；反相色譜柱（Smart RPC18，美國Grace公司）；HPLC（Waters 600）及熒光檢測系統(tǒng)（Waters 2475）（美國 Waters公司）；酶標(biāo)儀（FLx800，美國BioTek公司）。

1.2 方法

1.2.1 HPLC－熒 光 法 MLT 流 動 相 成 分 為Na2HPO435.8g／L，EDTA·2Na 0.372g／L 和30%甲醇，pH 6.4，檢測系統(tǒng)為Waters 2475熒光檢測器和Smart RPC18反相色譜柱（150mm×4.6mm，粒徑5μm），利用單泵恒流洗脫，柱溫為30℃，流速為0.9mL／min。熒 光 檢 測 器 設(shè) 定 激 發(fā) 波 長 為285nm，發(fā)射波長為345nm。

1.2.2 ELISA和 HPLC－熒光法的性能驗(yàn)證 性能驗(yàn)證所用的MLT標(biāo)準(zhǔn)品源自美國Sigma公司。ELISA法：（1）檢出限：在一塊酶標(biāo)板中同時(shí)做5孔陰性對照孔，以O(shè)D值大于陰性對照平均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差視為陽性，此時(shí)OD值對應(yīng)的MLT檢測濃度為檢出限。（2）線性范圍：檢測信號與標(biāo)準(zhǔn)樣濃度呈線性關(guān)系的范圍，把相當(dāng)于10倍陰性對照孔的標(biāo)準(zhǔn)差相應(yīng)的濃度規(guī)定為線性范圍的下限；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣濃度大于某一數(shù)值后，直線開始彎曲，檢測信號不再隨標(biāo)準(zhǔn)樣濃度的增加而線性增加，將此點(diǎn)對應(yīng)的濃度確定為上限。（3）精密度：在相同條件下，多次平行分析結(jié)果相互接近的程度，用偏差來表示；日內(nèi)精密度是指同一濃度標(biāo)準(zhǔn)樣在同一天內(nèi)檢測5次所得值的偏差；日間精密度是同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣在不同天內(nèi)檢測5次所得值的偏差。HPLC－熒光法：（1）將待測 MLT標(biāo)準(zhǔn)樣稀釋一系列濃度，進(jìn)樣分析，當(dāng)觀察哪個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣對應(yīng)信噪比（儀器直接讀出）為3時(shí)，此濃度即為檢出限。（2）線性范圍下限規(guī)定為噪聲（儀器直接讀出）的2倍所對應(yīng)的濃度，上限規(guī)定同ELISA 法。（3）精密度規(guī)定同ELISA法。

1.2.3 腦微透析術(shù)及透析液樣本的收集 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40mg／kg），固定于腦立體定位儀上。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，將微透析引導(dǎo)管置入 右側(cè)紋狀體（AP：＋1.0mm，MR：＋2.5mm，DV：－4.0mm），并用小螺絲和牙科水泥固定，靜養(yǎng)1周后進(jìn)行腦微透析術(shù)。在收集腦透析液過程中每只大鼠均單獨(dú)進(jìn)行，將大鼠放入清醒動物的自由活動裝置中，拔出引導(dǎo)針，插入微透析探針，用 Ringers液（140mmol／L NaCl，4mmol／L KCl，1.2mmol／L CaCl2，1mmol／L MgCl2，pH＝7.4）平衡灌流 1h 后，以 2μL／min 收集10：00，14：00，18：00，22：00，2：00 和6：00各 時(shí) 間 點(diǎn)下大鼠安靜、清醒狀態(tài)下的透析液樣本，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集3管，每管收集10min，樣本收集好后行色譜熒光法測定MLT含量，并取3管的平均值作為該時(shí)間點(diǎn)的MLT水平。在晚上收集樣本時(shí)注意避免白光，以免干擾MLT的晝夜節(jié)律。探針每次使用前先做探針體外回收率的測定，用以折算透析液樣本中MLT的濃度，并在透析后再次測定探針回收率，分析探針透析效能的變化。

1.2.4 血樣的采集及處理 于腦透析術(shù)后次日22：00，采集大鼠尾靜脈血液標(biāo)本1mL，4℃靜置過夜，1 000g離心20min，取上清。取50μL血清直接用ELISA法測定MLT含量，余下血清用三氯甲烷反復(fù)萃取，將三氯甲烷層真空干燥、氮?dú)獯蹈?、最后殘留物用流動相溶解進(jìn)樣，行色譜熒光法檢測MLT含量，并計(jì)算血清中MLT的提取回收率。

2 結(jié) 果

2.1 MLT檢測方法的建立 與ELISA法相比，HPLC－熒光法具有較低的檢出限值、呈較好的線性關(guān)系，日內(nèi)、日間精密度＜6%，重現(xiàn)性較好，具有靈敏、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)（表1）。

表1 2種褪黑素檢測方法的比較Tab 1 Comparison of two methods for detection of MLT levels

2.2 大鼠腦透析液及血清中的MLT含量測定

（1）用色譜法測定探針透析前、后對MLT的回收率分別為（13.10±1.13）%和（12.33±1.02）%，兩者差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n＝6，P＝0.508），提示探針對MLT透析效能比較穩(wěn)定。（2）用熒光檢測器測定22：00腦透析液及血清樣本中MLT，色譜檢測結(jié)果見圖1，MLT的分離效果良好，出峰時(shí)間在10min左右，22：00血清中的MLT峰面積明顯高于腦透析液（n＝8，P＜0.001）。（3）HPLC－熒光法測定2：00，6：00，10：00，14：00，18：00和22：00各時(shí)間點(diǎn)大鼠紋狀體腦透析液中的 MLT含量分別為（32.99±2.22），（18.25±2.27），（4.03±1.70），（2.92±1.08），（12.08±1.77）和（21.83±2.04）pg／mL，具有明顯的晝夜節(jié)律（圖2）。（4）HPLC－熒光法測定22：00血清中的 MLT含量為（82.62±8.09）pg／mL，提取回收率＞90%，血清與透析液中的MLT含量具有高度正相關(guān)（r＝0.987，P＜0.001）（圖3）；ELISA測定血清中的 MLT含量為（81.31±9.62）pg／mL，用2種方法測定血清中的MLT含量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.115）。

圖1 HPLC檢測正常大鼠紋狀體透析液和血清中22：00的褪黑素水平Fig 1 HPLC traces of MLT at 22：00in striatal dialysate and serum in normal rat

圖2 紋狀體透析液褪黑素水平在2：00，6：00，10：00，14：00，18：00和22：00的波動情況Fig 2 Fluctuations in MLT levels in striatal dialysate at 2：00，6：00，10：00，14：00，18：00and 22：00

圖3 腦透析液和血清中褪黑素水平的相關(guān)性Fig 3 Correlation between brain dialysate MLT and serum MLT

MLT主要由松果體以色氨酸為原料，經(jīng)過羥化、脫羧及N－乙酰轉(zhuǎn)移及甲基化等催化反應(yīng)合成的內(nèi)源性吲哚類激素，在體內(nèi)MLT水平相對較低，波動范圍較大，易受多種內(nèi)源性物質(zhì)的影響，一般較難測定。隨著對MLT的深入研究，有關(guān)MLT的檢測方法也得到相應(yīng)發(fā)展[3]。目前主要的測定方法有放射免疫分析法、ELISA法、HPLC－熒光法、HPLC－電化學(xué)法、HPLC－質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜（GC）－質(zhì)譜聯(lián)用法等。放射免疫分析法簡單、靈敏，但需放射性試劑，且與其結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)源性物質(zhì)易發(fā)生交叉反應(yīng)，重現(xiàn)性較差；HPLC－質(zhì)譜聯(lián)用法和GC－質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度和選擇性均很高，但操作復(fù)雜，成本高，且GC－質(zhì)譜聯(lián)用法需將樣本進(jìn)行柱前衍生后變成揮發(fā)性的物質(zhì)再檢測，不利于一般實(shí)驗(yàn)室的開展；ELISA法靈敏度低、耗時(shí)長、重現(xiàn)性尚可，且樣本前處理簡單；HPLC－熒光法簡單、快速、靈敏、重現(xiàn)性好、成本低，適合一般實(shí)驗(yàn)室的推廣。本研究在參考國內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的特點(diǎn)，對檢測條件進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，與已報(bào)道的方法相比[4－6]，本研究所用的HPLC－熒光檢測法，柱溫低（30℃）、出峰時(shí)間短（10min左右）、靈敏度高（檢出限為0.1pg／mL）、分離效果好（分離度＞1.2），且不經(jīng)衍生即可測定，是一種簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確、成本低、重現(xiàn)性好的測定MLT含量的方法。

3 討 論

MLT由松果體合成、分泌后一部分釋放入腦脊液，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，從而發(fā)揮中樞生物學(xué)效應(yīng)，且隨著年齡的增長，松果體合成MLT含量逐漸下降。近來的研究表明，MLT不僅是重要的睡眠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)物質(zhì)，其體液生理濃度的變化可能與某些疾病有關(guān)，許多疾?。ㄈ缡甙Y、抑郁癥、癌癥、帕金森病等[7－11]）的患者及動物模型MLT水平、分泌模式均發(fā)生了變化。為了更好地觀察MLT分泌模式，本研究采用腦微透析術(shù)動態(tài)收集成年大鼠紋狀體透析液，觀察晝夜各時(shí)間點(diǎn)MLT水平的變化。腦微透析術(shù)作為檢測細(xì)胞外神經(jīng)遞質(zhì)濃度的方法，近年來發(fā)展迅速，但同時(shí)也存在一些問題。例如，由于探針回收率變化等原因，實(shí)際透析液中待測物質(zhì)的濃度僅代表其在腦內(nèi)細(xì)胞外間隙濃度的部分水平，為此本研究在實(shí)驗(yàn)前對所用探針進(jìn)行體外相對回收率的測定，以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可比性。本研究使用的探針在體外對MLT的相對回收率為12%～13%，且透析前后探針回收率無顯著差異（n＝6，P＝0.508），提示在透析過程中探針的透析性能比較穩(wěn)定，可較為準(zhǔn)確地反應(yīng)腦內(nèi)的MLT水平。通常，在暗光條件下，哺乳動物開始分泌內(nèi)源性 MLT[12]。本研究選擇了6個(gè)時(shí)間點(diǎn)（2：00，6：00，10：00，14：00，18：00和22：00），從圖2可以看出，腦透析液中MLT含量具有明顯的晝夜節(jié)律，其分泌與光照有密切關(guān)系。白天含量非常低，一般＜5pg／mL，夜晚急劇升高，并于凌晨2點(diǎn)出現(xiàn)峰值（32.99±2.22）pg／mL，峰值出現(xiàn)時(shí)間與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，且 MLT在體內(nèi)半衰期較短[14]，均提示 MLT發(fā)揮效應(yīng)的時(shí)間主要在晚上。上午10點(diǎn) 以 后 降 至 5pg／mL 以 下，谷 值（2.92±1.08）pg／mL出現(xiàn)在14：00左右，18：00以后MLT分泌水平又開始增加，晚上22：00增至（21.83±2.04）pg／mL。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，8只正常成年SD大鼠MLT分泌起點(diǎn)及分泌模式基本一致，為進(jìn)一步研究藥物和光照等外界因素對機(jī)體生物鐘的影響提供了可能。

MLT由松果體分泌后一部分釋放入血液，通過外周組織器官靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，從而發(fā)揮外周生物學(xué)效應(yīng)。本研究采用 HPLC－熒光法和ELISA法檢測22：00大鼠血清中的MLT含量分別為（82.62±8.09）和（81.31±9.62）pg／mL，提示2種檢測方法差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有較好的一致性。但用色譜熒光法檢測血清中的MLT時(shí)，所需樣本量比較大，樣本前處理復(fù)雜，需經(jīng)三氯甲烷反復(fù)萃取，提取回收率為90%左右；而ELISA法所需樣本量小，不需對血清進(jìn)行處理，可直接進(jìn)行檢測。此外，本研究分析腦透析液和血液中MLT含量的變化，經(jīng)Pearson相關(guān)分析兩者呈高度正相關(guān)（r＝0.987，P＜0.001），血清 MLT含量的變化可間接反映腦內(nèi)MLT的變化趨勢。本研究還發(fā)現(xiàn)，22：00血清 MLT含量明顯高于腦透析液（n＝8，P＜0.001），推測松果體分泌MLT可能主要釋放入血液。

本研究結(jié)果表明，用改良的HPLC－熒光檢測法測定大鼠腦透析液以及血清中的MLT含量簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、成本低，血清中 MLT和腦內(nèi)MLT具有很好的相關(guān)性，且HPLC－熒光法和ELISA法測定血清MLT具有較好的一致性，為探究體內(nèi)MLT分泌模式、測定MLT含量提供一種有效的方法。

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