三種不同方法檢測抗雙鏈DNA抗體的比較分析

丁耀東，范雪麗，胡 彥，陳 華，譚立明，陳娟娟

(1、南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；2、南昌大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院；3、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006)

抗雙鏈DNA(double stranded DNA，dsDNA)抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的特異性抗體，其陽性率因檢測方法及病情而異，在20%～90%之間，但其特異性極高，且有研究表明，抗dsDNA抗體直接參與SLE病人的腎臟損害[1]，因此有效的檢測對SLE的臨床診斷及治療有

·論著·

三種不同方法檢測抗雙鏈DNA抗體的比較分析

丁耀東1，范雪麗2，胡 彥2，陳 華2，譚立明3，陳娟娟3

(1、南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；2、南昌大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院；3、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006)

目的比較三種不同方法檢測抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體的敏感度、特異度和符合度，并探討其與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）活動情況的一致性，以指導(dǎo)臨床工作。方法采用回顧性分析方法，對640例住院患者及健康體檢者血清標本進行研究，其中215例SLE患者，用間接免疫熒光法（IIF）、線性印跡法（LIA）、放射免疫分析法(RIA)同時檢測抗dsDNA抗體。結(jié)果抗dsDNA抗體用IIF、LIA和RIA法在SLE中的檢出率分別為40.00%、43.72%、47.44%，與對照組有顯著差異，三種方法特異性分別為98.35%、96.24%、94.59%，符合率分別為78.75%、78.59%、78.75%，具有極好的一致性（Kappa＞0.8）；三種方法在SLE活動期的檢出率分別為60.76%、58.23%、60.76%，與SLE穩(wěn)定期有顯著差異，用RIA檢測的抗dsDNA抗體的濃度與SLE活動性存在顯著的線性趨勢（P＜0.05）。結(jié)論抗dsDNA抗體不僅可以作為SLE患者的診斷標準還對其活動性的評估有著指導(dǎo)作用；三種方法學(xué)有著各自的優(yōu)缺點，有條件的醫(yī)院建議聯(lián)合采用兩種以上方法相互印證。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；雙鏈DNA抗體；間接免疫熒光法；線性印跡法；放射免疫法

抗雙鏈DNA(double stranded DNA，dsDNA)抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的特異性抗體，其陽性率因檢測方法及病情而異，在20%～90%之間，但其特異性極高，且有研究表明，抗dsDNA抗體直接參與SLE病人的腎臟損害[1]，因此有效的檢測對SLE的臨床診斷及治療有

1 資料與方法

1.1 研究對象標本來源以南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2012年1月-2015年5月間的381例住院患者，其中SLE患者215例，包括191例女性，24例男性，年齡為12～74歲；166例其他結(jié)締組織病患者作為疾病對照組，包括55例混合性結(jié)締組織病(MCTD)、6例干燥綜合征(SS)、74例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、12例系統(tǒng)性硬化癥(SSc)、4例強直性脊柱炎(AS)和15例皮肌炎(DM)患者。259例健康體檢者作為正常對照組。SLE診斷均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的SLE分類診斷標準[2]，SLE疾病活動程度的判斷依據(jù)2000年修訂的SLE疾病活動指數(shù)（SLEDAI-2000）進行評分：SLEDAI score<10分示SLE疾病穩(wěn)定期指標，SLEDAI score≥10分示SLE疾病活動期指標[3]。

1.2 檢測方法采集受試者肘靜脈血，離心分離血清。待檢血清抗dsDNA抗體同時使用間接免疫熒光法（IIF）、線性印跡法(LIA)、放射免疫分析（RIA）進行檢測。IIF和LIA均采用歐蒙醫(yī)學(xué)診斷公司的試劑，前者的抗原基質(zhì)片上包被綠蠅短膜蟲，并以異硫氰酸(FITC)標記的羊抗人IgG抗體為熒光二抗進行檢測，后者采用的是抗核抗體譜檢測試劑盒。RIA法采用北京北方生物技術(shù)研究所提供的抗ds-DNA抗體放射免疫分析試劑盒。操作步驟嚴格按各自說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)表示，多樣本均數(shù)的比較運用方差分析，偶然因素對觀察一致性的影響進行Kappa分析，Kappa值越高一致性越好，<0.2一致性可忽略不計，0.2～0.4較差一致性，0.4～0.6中度一致性，0.6～0.8較好一致性，> 0.8以上極好一致性。計數(shù)資料以百分率的形式表示，采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗dsDNA抗體三種方法在各組中的檢出率IIF法、LIA法、RIA法在SLE中的檢出率分別為40.00%、43.72%、47.44%，均明顯高于疾病對照組和健康體檢組（P<0.01），見表1。

2.2 三種方法學(xué)檢測抗dsDNA抗體對SLE的敏感性和特異性及一致性比較RIA敏感性最高，但特異性最低；IIF敏感性最低，特異性最高；LIA的敏感性和特異性在二者之間，三者有較好的符合率，見表2。

2.3 三種檢測方法聯(lián)合檢測作平行實驗IIF法與其他兩種方法的相關(guān)性比較（表1，2），結(jié)果顯示IIF法與其他兩種方法檢測比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）。以IIF為固定組，分別與RIA、LIA比較，Kappa值分別為0.813、0.889，三者有著極好的一致性（表3）。

表1 三種方法在各組中抗雙鏈DNA抗體的檢出率

表2 三種方法檢測抗ds-DNA抗體的敏感度和特異度及符合率

表3 IIF分別與RIF、LIF對檢出結(jié)果的一致性比較

2.4 SLE穩(wěn)定期與活動期及與其他結(jié)締組織病抗dsDNA抗體陽性率的比較SLE活動期三種方法學(xué)檢測抗dsDNA抗體的差異性較小，但在SLE穩(wěn)定期較活動期差異更為顯著，存在多例IIF檢測抗dsDNA抗體陰性及部分LIA陰性而RIA陽性的標本(P<0.05)(表4)。在對照組內(nèi)，三種方法下的dsDNA檢出率略有差別。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、混合性結(jié)締組織病，干燥綜合征和體檢者中用IIF檢測到抗dsDNA抗體陽性率分別為0.00、5.45、0.00和0.02，LIF為0.00、7.27、16.67和0.04，而RIA結(jié)果分別為5.41、7.27、16.67和0.05?？梢奟IA的假陽性率高于其他兩組（見表4），但三種方法檢測抗dsDNA抗體在總的疾病對照組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 各組抗dsDNA抗體濃度與疾病活動度的關(guān)系比較及線性趨勢檢驗RIA檢測出健康及疾病對照組、SLE穩(wěn)定組和SLE活動組的抗dsDNA抗體濃度總體均數(shù)及各組均數(shù)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 39.257，P＜0．05)。各組抗dsDNA抗體濃度均數(shù)的線性趨勢檢驗結(jié)果顯示(F=58.935，P＜0．05)各組抗ds-DNA抗體的濃度均數(shù)間呈線性趨勢(P＜0.05)。見表5，圖1。

表4 SLE穩(wěn)定期與活動期及與其他結(jié)締組織病抗dsDNA抗體陽性率的比較

表5 放射免疫分析法各組抗dsDNA抗體濃度均數(shù)比較及線性趨勢檢驗

圖1 對照組、SLE穩(wěn)定組和SLE活動組抗dsDNA抗體濃度均數(shù)與疾病活動度關(guān)系圖

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種嚴重危害人類健康的自身免疫性疾病，SLE的患病率因人群而異，全球平均患病率為12～39/10萬，我國患病率為30.13～70.14/10萬，以女性多見，尤其是20～40歲的育齡女性。由于SLE的發(fā)病機制至今未明，為其根治帶來極大困難。在20世紀50年代SLE的5年存活率僅為20%，曾受到全世界各國醫(yī)學(xué)專家的高度重視。經(jīng)過60多年來的研究，除美國風(fēng)濕病學(xué)會1982年修定的系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷標準為診斷SLE的主要標準外，SLE實驗室診斷的應(yīng)用顯著地提高了SLE的檢出率，改善了10年存活率。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中存在多種抗體，其抗dsDNA抗體是SLE患者血清存在的一種能與天然的脫氧核糖核酸（DNA）結(jié)合的成分。有研究證明抗dsDNA抗體參與SLE的病理過程，在疾病形成的過程中，dsDNA和其抗體形成的免疫復(fù)合物沉淀在皮下毛細血管、腎和其他器官內(nèi)，激活補體系統(tǒng)，從而導(dǎo)致組織的損傷[4，5]；因其具有致病性，有效的治療可使其滴度下降或轉(zhuǎn)陰，是觀察治療效果的唯一抗體。因此，抗dsDNA抗體不僅有助于對SLE的診斷，還可以判斷SLE的活動性及療效的評價。本實驗利用IIF、RIA和LIA對SLE組(包括SLE疾病穩(wěn)定組和疾病活動組)及其他結(jié)締組織疾病、健康對照組中抗dsDNA抗體檢測分析，發(fā)現(xiàn)三種方法在SLE組的檢出率明顯高于疾病對照組和健康對照組，但其檢出率低于王許娜等報道[6]，這可能與不同地區(qū)，不同種族及方法學(xué)的差異等因素造成的。在SLE組中的特異性都在94%以上，并且具有很高的符合率，此結(jié)果與已報道的文獻相符[4，7，8]。此外，本研究表明在針對SLE疾病活動性檢測時，三種方法在SLE患者疾病活動期，對抗dsDNA抗體檢出率明顯增高，分別為60.76%，58.23%，60.76%。RIA法檢測出健康對照及疾病對照組、SLE穩(wěn)定組和SLE活動組的抗dsDNA抗體濃度總體均數(shù)及各組均數(shù)之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，且SLE疾病活動度與抗dsDNA抗體的濃度呈線性趨勢。這說明抗dsDNA抗體與SLE的疾病活動度密切相關(guān)，其抗體效價隨疾病的活動或緩解而升降與文獻一致[9，10]。因此測定血清抗dsDNA抗體對SLE活動度的識別、判定具有很高價值。

IIF法特異性較RIA法高，在檢測抗dsDNA抗體時，因綠蠅短膜蟲是一種血鞭毛蟲，其動基體內(nèi)含大量的純dsDNA，不含ssDNA及其他細胞核抗原，抗原性比較特異，所以特異性較高[11]。但其敏感性較RIA低，RIA檢測抗dsDNA抗體由于采用的是生物提取的dsDNA作為實驗基質(zhì)，在制備過程中，DNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)位點可能少部分人為暴露，從而會因抗ssDNA抗體的存在產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，因此假陽性比較多[12]，本研究結(jié)果證實了這一點。LIA的敏感性和特異性也較高，在二者之間，同時由于其易于判讀結(jié)果，且對于不確定的熒光模型可以作為一個確認型的診斷有著重要的意義[13-15]，同時由于國內(nèi)目前多采用IIF法和RIA檢測，這些檢測方法因操作過程復(fù)雜、人為影響因素多、需要特殊儀器并且RIA標記技術(shù)存在放射性污染、試劑盒有效期短等缺陷，限制了在基層單位的開展，LIA法操作方便，不需要特殊設(shè)備，適合基層醫(yī)院及標本量較多的實驗室進行篩查。同時結(jié)合RIA檢測抗dsDNA抗體的濃度可以判斷SLE的活動度和治療效果，有利于指導(dǎo)臨床治療，因此，建議有條件的醫(yī)院同時采用兩種以上的檢測方法，以便結(jié)果可以互相印證。

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《實驗與檢驗醫(yī)學(xué)》編輯部

Comparative analysis of three different methods to detect anti-double-stranded DNA antibodies

DING Yaodong，CHEN Juanjuan，TAN Liming，et al.
School of Public Health，Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Objective To analyze the sensitivity，specificity and coincidence rate of three methods for detecting anti-double stranded DNA(anti-dsDNA)antibody，and to explore the correlation of anti-dsDNA results and activity of systemic lupus erythematosus(SLE).Methods Anti-dsDNA antibody from 640 cases of inpatient and healthy controls，including 215 cases of SLE were measured by indirect immunofluorescence(IIF)，linear imprinting assay(LIA)and radioimmunoassay(RIA).Then the data were analyzed using retrospective method.Results The detectable rates of anti-dsDNA antibody in SLE by IIF，LIA and RIA were 40. 00%，43.72%and 47.44%respectively，with significant differences against the control group.The specificity of the three methods were 98.35%，96.24%and 94.59%respectively，in which the coincidence rates were 78.75%，78.59%and 78.75%respectively (kappa＞0.8).Of all the active SLE case diagnosed by the methods of IIF，LIA and RIA the detectable rates were 60.76%，58.23% and 60.76%respectively，which significantly differentiate stable SLE from active SLE.Moreover，the concentration of anti-dsDNA antibody by RIA and the activity of SLE were found to exist in an outstanding linear trend（P＜0.05）.Conclusion Anti-dsDNA antibody played an important role in the diagnosis and active evaluation of SLE，which suggested the combination usage of two or more methods if possible.

Systemic Lupus Erythematosus(SLE)；Double-stranded DNA antibody(dsDNA)；Indirect immunofluorescence method(IIF)；Linear imprinting assay(LIA)；Radioimmunoassay(RIA)重要意義。目前臨床常用的檢測方法有綠蠅短膜蟲IIF、LIA、RIA、膠體金斑點法(DIGFA)及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等，但不同檢測方法的敏感度、特異度有所差異，臨床應(yīng)用各有利弊。本研究以IIF、LIA、RIA三種方法分別檢測抗dsDNA抗體，對各種方法的敏感度、特異度及疾病活動期時的檢出率進行對比分析，選出實用的檢測方法，供臨床參考。

R446.62

A

1674-1129(2015)06-0697-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2015.06.002

2015-10-16；

2015-11-21)

國家自然科學(xué)基金青年基金（81401964）；江西省青年科學(xué)基金（20142BAB215058）；江西省教育廳青年基金（GJJ14185）；南昌大學(xué)創(chuàng)新學(xué)分項目（14001849）。

丁耀東，女，1989年11月生，南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，2011級醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)。

陳娟娟，女，1983年4月生，博士，主治醫(yī)師，研究方向為臨床免疫檢驗，腫瘤免疫。