生物顯微鏡數(shù)字圖像白平衡的影響因素研究

袁　超，趙　彤，敖育健，程　環(huán)

生物顯微鏡數(shù)字圖像白平衡的影響因素研究

袁超，趙彤，敖育健，程環(huán)

目的：研究生物顯微鏡數(shù)字圖像白平衡的影響因素及如何調整獲得最佳結果。方法：用色溫儀分別測量各因素作用時的數(shù)據(jù)及其之間的相互影響，用SASS軟件進行統(tǒng)計學分析。結果：物鏡的使用可以增加色溫200～300 K，使用LBD濾色片可增加色溫值400～1 800 K，減小視場光闌90%可降低色溫約400 K，ND6濾光片、ND25濾光片、孔徑光闌對色溫無影響。結論：生物顯微鏡中各電學、光學元器件的參數(shù)要經(jīng)過科學的調整才能獲得數(shù)字圖像正確的白平衡。

顯微鏡數(shù)字圖像；白平衡；色溫；LBD濾色片；ND6/ND25濾光片

0　引言

影響顯微鏡數(shù)字圖像質量的因素很多，如分辨率、清晰度、白平衡、對比度、像素、噪聲、動態(tài)范圍等[1]。白平衡也可以稱為色溫，色溫是表示光源光譜質量最通用的指標，可以通俗地認為是表示光的顏色冷暖的物理參數(shù)。開爾文認為，假定某一純黑物體，能夠將落在其上的所有熱量吸收而沒有損失，同時又能夠將熱量生成的能量全部以“光”的形式釋放出來，它產生輻射最大強度的波長隨溫度變化而變化[2]。人眼對色溫是不敏感的，而電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）則可真實記錄色溫，因此顯微鏡在數(shù)字成像時準確控制色溫非常重要。影響顯微鏡圖像色溫的因素有鹵素燈泡電壓、視場光闌、孔徑光闌、LBD濾色片、ND6濾光片、ND25濾光片等。本文主要研究各種因素對色溫的影響以及怎樣組合才能獲得最準確的色溫（5 500 K）。

1　材料與方法

1.1設備

Olympus BX53正置顯微鏡，配置12 V、100 W鹵素燈泡，電壓0～12 V可調，配備有視場光闌、孔徑光闌、LBD濾色片、ND6和ND25濾光片、DP72制冷CCD、CELLSENCE圖像分析軟件及計算機硬件；柯尼卡美能達CL-500A色溫儀。

1.2標本制備步驟

活體組織病理切片—石蠟包埋—蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.3測試方法與步驟

1.3.1驗證不同物鏡對色溫的影響

方法：取出目鏡觀察筒中的目鏡，將色溫儀對準觀察筒，使二者間沒有孔隙（如圖1所示）。選擇一個物鏡，點亮鹵素燈泡，先后選擇1～12 V整數(shù)位共計12個電壓值，用色溫儀測量記錄不同電壓時的讀數(shù)，測量3次取其平均值記錄，然后更換不同物鏡，重復以上步驟。

圖1　驗證不同物鏡對色溫的影響

2　結果與分析

2.1不同物鏡對色溫的影響

實驗測得的數(shù)據(jù)見表1，編寫并運行SASS程序，得到統(tǒng)計學分析結果見表2。結果顯示，用和不用物鏡結果有統(tǒng)計學差異，100×物鏡與其他物鏡結果有統(tǒng)計學差異。但在實際測量中，光透過100×物鏡后變得很弱，色溫儀測量時間顯著延長，從而使測量結果出現(xiàn)一定程度的偏差。除100×物鏡外，光經(jīng)過物鏡后色溫增加約200～300 K（如圖3所示），圖中系列1～6分別為無物鏡、4×物鏡、10×物鏡、20×物鏡、40×物鏡、100×物鏡時測得的色溫值隨電壓變化曲線。

表1　不同物鏡下實驗測得的色溫值

表2　物鏡對色溫的影響結果

圖3　不同物鏡對色溫的影響曲線

2.2電學、光學元器件對色溫的影響

測得的數(shù)據(jù)制成表3，編寫并運行SASS程序，得到統(tǒng)計學分析結果見表4。結果顯示，用和不用LBD濾色片結果有統(tǒng)計學差異；視場光闌減少90%與各組結果有統(tǒng)計學差異；孔徑光闌、ND6濾光片、ND25濾光片對結果無統(tǒng)計學影響。只使用鹵素燈泡、不使用光學元器件時，色溫較低。電壓越低、色溫越低，電壓越高、色溫越高。LBD濾色片的使用對色溫值的改變具有顯著影響，使用該濾色片可大大增加色溫值，增加量為400～1 800 K。減小視場光闌90%對色溫有影響，可降低色溫約400 K。ND6濾光片、ND25濾光片、孔徑光闌對色溫無影響（如圖4所示）。圖中系列1～6分別為無濾色片和光闌、單LBD濾色片、90%單孔徑光闌、90%單視場光闌、單ND6濾光片以及單ND25濾光片時的色溫值隨電壓變化的曲線。

表3　不同電學、光學元器件下實驗測得的色溫值K

表4　電學、光學元器件對色溫的影響結果

圖4　電學、光學元器件對色溫的影響曲線

3　討論

色溫對顯微鏡的圖像質量有重要影響，主要表現(xiàn)在光源的色溫會影響到圖像色彩的還原[3]。在生物醫(yī)學中，通過多種染色技術使不同細胞、組織或細胞的不同成分具有不同的顏色，借此加以區(qū)分。如果色溫不準確，就會使本來紅色的細胞質顯示為紫色，本來藍色的細胞核顯示為黑色[4]。日常生活中，比如在路燈下面，衣服或者其他物體的顏色會顯得很不一樣，這就是光源色溫影響了大腦對于物體顏色的判斷，對于顯微鏡的CCD也會有同樣的問題。人眼對顏色有自我適應的功能，這使我們不管是在日光、熒光燈、鎢絲燈下看到的白色物體仍然是白色，只有在一些比較極端的情況下才會有偏差，而顯微鏡CCD的傳感器與此不同，會顯示物體的真實顏色色溫。調整白平衡的過程稱為白平衡調整，白平衡調整的基本原理是對于低色溫的光源，其中的紅光占比例較高，我們就可以降低紅光的比例，提高藍光的比例，從而使各種顏色達到平衡，讓白色呈現(xiàn)出本來的白色。對于高色溫的光源也是類似，通過降低藍光比例，提高紅光比例來達到調整白平衡的目的[5]。

LBD濾色片也叫做白平衡濾色片[6]，其作用類似于藍色濾色片，可以將光路中一部分黃光濾掉，在燈泡電壓較低、光偏黃時作用有限，只有與適當電壓相配合時才能將光濾成接近白色。ND濾光片也被稱為中灰濾光片，其作用是降低光的強度而不改變光的顏色，ND6濾光片的作用是濾掉94%的光量而剩下6%的光強[7]。

通過對以上實驗因素的分析總結得到數(shù)字圖像色溫偏低、圖像偏黃的原因有：未使用LBD濾色片；使用LBD濾色片、低倍鏡時未使用ND6/ND25濾光片，為使圖像不過亮過曝，燈泡電壓遠不到12 V；使用LBD濾色片、低倍鏡時未使用ND6/ND25濾光片，為使圖像不過亮、過曝，嚴重縮小視場光闌。數(shù)字圖像色溫偏高、圖像偏黃藍的原因有：未使用LBD濾色片，為克服圖像偏黃，加了藍色濾色片；使用LBD濾色片，設置正確后又加了藍色濾色片；使用LBD濾色片、低倍鏡時，燈泡電壓給的太低，圖像偏黃，后加了藍色濾色片；使用LBD濾色片、低倍鏡時，嚴重縮小視場光闌圖像偏黃，后加了藍色濾光片。

綜合分析，為得到最準確的白平衡和最佳圖像質量，技術流程為：（1）將燈泡電壓置于12 V固定不變；（2）將LBD濾色片放置于光路中；（3）將視場光闌全部打開；（4）選擇合適物鏡；（5）調整孔徑光闌，使其數(shù)值=物鏡數(shù)值孔徑（NA）值×80%[8]；（6）根據(jù)物鏡倍數(shù)大小，選擇ND濾光片組合：4×物鏡時選擇ND6+ND25濾光片；10×物鏡時選擇ND6濾光片；20×物鏡、40×物鏡時選擇ND25濾光片；100×物鏡時全不選。

[1]袁超，程環(huán).顯微鏡數(shù)字圖像的質量控制[J].醫(yī)療衛(wèi)生裝備，2012，33（10）:100-103，120.

[2]葉永沛.色溫濾色片的設置與白平衡的校正運用技術[J].電視制作，2014（3）:52-53.

[3]張數(shù)霖.近場光學顯微鏡及其應用[M].北京:科學出版社，2000.

[4]宋菲君.近代光學信息處理[M].北京:北京大學出版社，1998.

[5]高寶昌.數(shù)碼相機的色溫和白平衡[J].照相機，2013（7）:29-33.

[6]李文忠.日本Olympus顯微鏡用的濾色片[J].北京生物醫(yī)學工程，1986（2）:57-59.

[7]紀孝陽.光電器件生產中光源色溫正確標定的重要性[J].紅外技術，1984（5）:26-36.

[8]郭嘉泰.影響顯微鏡分辨率的幾種因素[J].中國醫(yī)學物理學雜志，2013，20（4）:278-279.

（收稿：2014-05-16修回：2014-09-09）

（欄目責任編校:李影）

Factors affecting digital image white balance of biological microscope

YUAN Chao1,ZHAO Tong2,AO Yu-jian3,CHENG Huan1
(1.Experimental Instrument Plant,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China; 2.Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China; 3.Beijing Lead-color Technology Development Co.,Ltd.,Beijing 100390,China)

Objective To study the influencing factors of digital image white balance of the biological microscope and the way to obtain optimized image.Methods Color temperature meter was used to measure the influences of the factors and their correlations,and SASS software was employed for statistical analysis.Results Object lens might increase the color temperature by 200 to 300 K,LBD color filter could enhance it by 400 to 1 800 K.Reducing field stop by 90%might decrease color temperature by 400 K.ND6 filter,ND25 filter and aperture diaphragm had no influences on color temperature.Conclusion The electric and optical parameters of biological microscope have to be adjusted to gain proper white balance for digital image.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（5）：95-97]

microscope digital image;white balance;color temperature;LBD color filter;ND6/ND25 filter

[中國圖書資料分類號]R318.6；TH773A

1003-8868（2015）05-0095-03

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.05.095

袁超（1979—），男，工程師，主要從事醫(yī)學實驗儀器計量、維修等方面的研究工作，E-mail:7book@163.com。

100850北京，軍事醫(yī)學科學院實驗儀器廠（袁超，程環(huán)）；100850北京，軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所（趙彤）；100390北京，北京利凱樂科技發(fā)展有限公司（敖育?。?/p>

1.3.2驗證各光學元器件對色溫的影響

方法：將色溫儀的測光口對準顯微鏡聚光鏡的出光口，由于二者大小契合，可以不做密閉連接裝置（如圖2所示）。分別選擇什么都不使用，使用LBD濾色片、視場光闌、孔徑光闌、ND6濾光片、ND25濾光片，測試在1～12 V共計12個整數(shù)電壓值下色溫儀的讀數(shù)，測量3次取其平均值記錄。

圖2驗證各光學元器件對色溫的影響