構(gòu)樹皮總黃酮提取及抗菌活性研究

開偉華，寇婉青，程 正，錢世兵，陳葉平

（1．銅陵職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，安徽 銅陵 244000；安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；3．銅陵市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽 銅陵 244000）

構(gòu)樹（Broussonetiapapyrifera（L．）Vent．）為?？茦?gòu)屬喬木，雌雄異株，又名谷漿樹、楮桃樹、沙紙樹。構(gòu)樹的藥用價(jià)值很高，其根、皮、葉、漿、果實(shí)和種子均可入藥，具有抗氧化、抗血小板凝聚、降壓、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫和抑菌等作用［1］。其中，構(gòu)樹的抑菌作用一直受到人們的關(guān)注，如《本草綱目》云：“去風(fēng)濕腫脹，癬瘡?！薄妒セ莘健酚涊d：“治癬濕癢不可忍，構(gòu)樹葉半斤，細(xì)切，搗令極爛，敷于癬上。”

構(gòu)樹皮又名楮樹皮，性味甘平，能祛風(fēng)、活血、利尿，可用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、虛腫、皮炎等。構(gòu)樹皮的化學(xué)成分主要為黃酮類、二苯丙烷類化合物以及香豆素、萜類、生物堿、脂肪油等［2－4］，黃酮類成分是構(gòu)樹皮多類化學(xué)成分中的主要成分，可作為特征性成分對(duì)其提取物進(jìn)行表征。本研究采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化構(gòu)樹皮黃酮最佳提取工藝，并采用大孔吸附樹脂富集構(gòu)樹皮總黃酮，比較不同洗脫部位抑菌效果，尋找構(gòu)樹皮有效的抑菌活性部位。

1 材料

1．1 藥品與試劑 構(gòu)樹皮：安徽亳州中藥材市場(chǎng)；98%槲皮素對(duì)照品：Sigma Aldrich；AB－8大孔樹脂：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯化鋁（分析純）：Sigma Aldrich；其他試劑均為分析純。紅色毛癬菌、白色念珠菌：安徽銅陵市食品藥品檢驗(yàn)所微生物室提供。

1．2 主要儀器 T6紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；電子分析天平：Shimadzu；鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2．1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇［5－7］取構(gòu)樹皮粗提物適量，精密稱定，加甲醇使溶解，搖勻，制成含10mg／mL構(gòu)樹皮提取物溶液，作為供試品溶液。另取105℃干燥至恒質(zhì)量的槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成0．1mg／mL槲皮素溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取槲皮素對(duì)照品儲(chǔ)備液和供試品溶液各1．0mL，分別加入1%三氯化鋁甲醇溶液各1 mL，搖勻，放置15min后，在200～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以不加槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液為空白，記錄掃描圖（見圖1）。樣品在270nm處的最大吸收峰和槲皮素吸收峰的重合度好，因此選擇270nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取槲皮素對(duì)照品儲(chǔ)備液0、0．5、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0mL，分別置10mL具塞試管中，各加入1%三氯化鋁－甲醇溶液1mL，并加甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min，以不加槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液為空白，于270nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線A＝0．027C＋0．004 9，r＝0．999 8，說明槲皮素含量在0～50μg／mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2．3 構(gòu)樹皮總黃酮提取 稱取構(gòu)樹皮干燥粉末10．0g，加入不同體積倍數(shù)的乙醇，采用超聲處理，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑濃縮至干，得到構(gòu)樹皮粗提物。分別稱取構(gòu)樹皮粗提物，配置成10mg／mL供試品溶液，精密量取供試品液各1．0mL，分別加入1%三氯化鋁甲醇溶液各1mL，搖勻，放置顯色15 min后，由回歸方程求出稀釋液中總黃酮類化合物濃度，計(jì)算出構(gòu)樹皮總黃酮提取率。總黃酮提取率按下式計(jì)算：總黃酮含量＝（總黃酮量／浸膏量）×100%。

采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用不同的乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲時(shí)間（C）、超聲功率（D）為試驗(yàn)因素，優(yōu)化超聲法提取構(gòu)樹皮總黃酮最佳工藝參數(shù)，具體因素水平安排見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2．4 構(gòu)樹皮總黃酮富集 稱取構(gòu)樹皮干燥粉末100．0g，按最佳提取工藝，超聲提取，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑至無醇味，濃縮液過濾后加水稀釋為0．5g／mL生藥溶液，按照藥液－樹脂比約1∶5上AB－8大孔吸附樹脂，依次以蒸餾水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇梯度洗脫，分別收集各流分，回收溶劑至干，分別得到30%、50%、70%、90%乙醇洗脫部位，按照“2．3”項(xiàng)下方法操作，自“加1%三氯化鋁甲醇溶液”起，依法測(cè)定吸收度，計(jì)算出不同洗脫部位中總黃酮含量。

2．5 構(gòu)樹皮不同活性部位體外抑菌作用試驗(yàn)［8－9］選用紅色毛癬菌和白色念珠菌，用平皿藥基法［10－11］，以沙堡瓊脂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別取30%、50%、70%、90%乙醇洗脫部位濃縮提取物0．1g溶于適量水中，置100mL量瓶中，用滅菌雙蒸餾水稀釋至刻度。精密量取藥液0．1mL加入8mL瓊脂培養(yǎng)基中混勻，用滅菌雙蒸餾水稀釋成不同濃度，以溶劑及其基礎(chǔ)為對(duì)照，用菌懸液法配成相當(dāng)于0．5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙簜溆?，接種，培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（26±1）℃，時(shí)間為7d，觀測(cè)抑菌效果。

3 結(jié)果

3．1 構(gòu)樹皮總黃酮提取試驗(yàn) 正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果見表3。由方差分析結(jié)果可知，總黃酮提取優(yōu)選工藝條件為A2B1C2D3，而從極差看出影響總黃酮含量的主要影響因素為乙醇濃度和超聲時(shí)間，從節(jié)約能源角度確定總黃酮提取最佳工藝為A2B1C1D1，即以10倍體積70%乙醇冷浸，超聲20min，功率300W，總黃酮提取率最高。由表3可知，因素A對(duì)提取工藝有顯著性影響，因素B、C、D對(duì)提取工藝的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3．2 構(gòu)樹皮總黃酮驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取構(gòu)樹皮干燥粉末10．0g，按最佳工藝重復(fù)做3次，測(cè)得總黃酮含量平均值為2．18%。

表2 構(gòu)樹皮總黃酮的L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

3．3 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取構(gòu)樹皮干燥粉末10．0g，按最佳工藝重復(fù)做3次，測(cè)得總黃酮含量平均值為2．18%。

3．4 構(gòu)樹皮總黃酮富集分離 對(duì)得到的各乙醇洗脫部位測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果見表4?？傸S酮含量：70%乙醇洗脫部位＞50%乙醇洗脫部位＞30%乙醇洗脫部位＞90%乙醇洗脫部位。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

表4 構(gòu)樹皮各部位總黃酮含量

3．5 構(gòu)樹皮各部位體外抑菌試驗(yàn) 構(gòu)樹皮提取物30%、50%、70%、90%乙醇洗脫部位提取物對(duì)紅色毛癬菌和白色念珠菌均有一定的抑制作用，70%乙醇洗脫部位抑菌作用最強(qiáng)，50%乙醇洗脫部位次之，30%乙醇洗脫部位和90%乙醇洗脫部位抑菌作用最差，這與各部位總黃酮含量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。見表5。

表5 不同濃度乙醇洗脫部位雙蒸餾水液的抑菌作用

4 討論

淺部真菌病是皮膚科臨床最常見的皮膚病，是由寄生于角蛋白組織的致病真菌所引起的皮膚病。致病菌主要為皮膚癬菌，其次為淺部念珠菌，感染人體后可引起組織反應(yīng)而發(fā)生紅斑丘疹、水皰、鱗屑、斷發(fā)、脫發(fā)和甲板改變等。目前，針對(duì)淺部真菌病的治療，己開發(fā)了多種口服和外用抗真菌藥物?；瘜W(xué)藥物具有一定的抗真菌作用，但由于真菌感染率的不斷增加，真菌耐藥菌株日益增多，加之化學(xué)藥物的毒性和不良反應(yīng)以及耐藥性的產(chǎn)生，使得化學(xué)藥物治療難度不斷增大，這種現(xiàn)狀迫切要求人們不斷尋找高效低毒的抗真菌藥物。因此，從中草藥中有效地提取、篩選抗真菌活性成分，尋找安全性好、抗菌譜廣、療效高的抗真菌藥物已成為一個(gè)重要的研究方向［12］。

構(gòu)樹因其耐旱、耐濕、耐冷、萌芽力強(qiáng)，在自然界中有很強(qiáng)的適應(yīng)性，在我國(guó)黃河兩岸、大江南北、平原山區(qū)隨處可見，資源非常豐富。本研究通過對(duì)構(gòu)樹皮總黃酮的提取、純化以及不同洗脫部位的體外抑菌試驗(yàn)，確定構(gòu)樹皮最佳提取工藝為：取構(gòu)樹皮粉末，以10倍體積的70%乙醇為溶劑，超聲提取20 min，功率300W，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑至無醇味，再經(jīng)AB－8大孔吸附樹脂富集，依次以蒸餾水、30%、50%、70%和90%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫部位，濃縮至干，即得。該工藝操作簡(jiǎn)單、耗能低、總黃酮提取率高，對(duì)淺部真菌紅色毛癬菌和白色念珠菌均有良好的抑制作用，為進(jìn)一步開發(fā)抑菌活性強(qiáng)、質(zhì)量可控、性質(zhì)穩(wěn)定且毒性和不良反應(yīng)小的抑制淺部真菌制劑奠定了基礎(chǔ)。

（銅陵市食品藥品檢驗(yàn)所管大平對(duì)構(gòu)樹原料進(jìn)行了鑒定，銅陵市食品藥品檢驗(yàn)所微生物室提供了菌種，謹(jǐn)致謝意?。?/p>

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