溫腎養(yǎng)血方對(duì)無(wú)排卵模型大鼠卵巢質(zhì)量和形態(tài)的影響

辛明蔚，張秋霞，趙 暉，楊亦龍，何軍琴，梁欣韞，張 瑩，楊 維，武 穎，尹曉丹

（1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100026；2．首都醫(yī)科大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100069；3．首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

溫腎養(yǎng)血方是北京婦產(chǎn)醫(yī)院中醫(yī)科趙松泉教授的經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用30余年，療效顯著［1－3］。為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)利用無(wú)排卵大鼠動(dòng)物模型，以溫腎養(yǎng)血方進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)觀察大鼠子宮和卵巢質(zhì)量、卵巢形態(tài)學(xué)等相關(guān)指標(biāo)，闡明溫腎養(yǎng)血方促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用。

1 材料

1．1 藥物 實(shí)驗(yàn)用中藥飲片購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司。溫腎養(yǎng)血方為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院趙松泉主任醫(yī)師自擬方，由柴胡、香附、木香、赤芍、澤蘭、益母草、牛膝、雞血藤、紅花、丹參、當(dāng)歸、川芎、蒲黃、熟地黃、淫羊藿、山茱萸、菟絲子、枸杞子、覆盆子、鹿角、羌活、細(xì)辛、肉蓯蓉等組成。水煎后濃縮成含生藥2．6g／mL的藥液，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩ｈ蹤此崧让追移?，每?0mg，高特制藥有限公司·塞浦路斯生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)為ED104。

1．2 儀器 JA－1003電子分析天平：上海精科天平廠(chǎng)；LEICA RM2235輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)，LEICA HI1210攤片機(jī)，LEICA EG1150H 包埋機(jī)：德國(guó)；Nikon生 物 顯 微 鏡，NIS－Elements Basic Research圖像采集分析系統(tǒng)：日本。

2 方法

2．1 動(dòng)物分組及模型復(fù)制 將50只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組，溫腎養(yǎng)血方大、中、小劑量組，西藥組，每組10只。另取22日齡大鼠10只作為正常組。

無(wú)排卵大鼠模型［4］（即雄激素致不孕大鼠模型）的復(fù)制：取9日齡SPF級(jí)雌性SD大鼠，于頸背部皮下注射丙酸睪酮1．25mg（0．05mL），至70日齡時(shí)陰道開(kāi)口。連續(xù)陰道涂片2個(gè)性周期（每個(gè)性周期為5d），陰道上皮無(wú)性周期變化，提示無(wú)排卵大鼠模型復(fù)制成功。同樣，取9日齡雌性SD大鼠10只（正常組），于頸背部皮下注射等量蒸餾水，至70日齡時(shí)陰道開(kāi)口。實(shí)驗(yàn)組及正常組均于22日齡時(shí)斷奶，利用自然光照，室溫維持在20℃左右，同樣條件飼養(yǎng)，由專(zhuān)人飼養(yǎng)。

2．2 給藥方法 模型動(dòng)物分組完成后，從80日齡起，分別給予相應(yīng)藥物。模型組和正常組給予12 mL／kg蒸餾水。西藥組給予5．8mg／kg（臨床等效劑量）枸櫞酸氯米芬蒸餾水混懸液，每日灌胃1次，5d停藥。溫腎養(yǎng)血方小、中、大劑量組分別給予溫腎養(yǎng)血方13、26、52mg／kg，分別相當(dāng)于成人臨床劑量的3．5、7．0、14．0倍，每日灌胃1次，連續(xù)21d。

2．3 取材方法 各組大鼠連續(xù)灌胃結(jié)束后，斷頭處死，取出子宮、雙側(cè)卵巢，去掉周?chē)窘M織，將子宮、卵巢迅速置于電子天平，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)。

2．4 卵巢組織切片的制備 以上摘取的卵巢，置于4%多聚甲醛固定8～24h，脫水，透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm，用于蘇木精－伊紅（hematoxylin－eosin，HE）染色。

2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。由于這是單因素非平衡設(shè)計(jì)的組合實(shí)驗(yàn)，故按研究目的分成3個(gè)組合。①正常組、模型組：采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量指數(shù)，采用 Mann－WhitneyU檢驗(yàn)比較子宮指數(shù)；②模型組和溫腎養(yǎng)血方大、中、小劑量組：采用單因素方差分析比較多組均數(shù)，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)的多重比較；③西藥組和溫腎養(yǎng)血方大、中、小劑量組：采用單因素方差分析比較多組均數(shù)，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)的多重比較。P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 模型因素對(duì)大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化（P＞0．05），子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)顯著減少（P＜0．05）。見(jiàn)表1。

表1 模型因素對(duì)大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響（±s）

表1 模型因素對(duì)大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響（±s）

注：與正常組比較，P＜0．05。

組別 n 體質(zhì)量／g子宮指數(shù)／（g／k g）卵巢指數(shù)／（g／k g）正常1 0 2 3 8．5 8±1 8．2 9 2．4 1±1．1 4 0．7 6±0．1 4模型 1 0 2 4 5．9 6±1 7．8 8 1．3 8±0．3 0＊ 0．4 0±0．0 8＊

3．2 藥物治療對(duì)無(wú)排卵模型大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響 與模型組比較，各治療組大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)均無(wú)明顯變化（P＞0．05）；各治療組之間體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)比較，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表2。

表2 藥物治療對(duì)無(wú)排卵模型大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響（±s）

表2 藥物治療對(duì)無(wú)排卵模型大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響（±s）

組 別 n 體質(zhì)量／g子宮指數(shù)／（g／k g）卵巢指數(shù)／（g／k g）模 型1 0 2 4 5．9 6±1 7．8 8 1．3 8±0．3 0 0．4 0±0．0 8西 藥 1 0 2 1 4．0 5±1 9．5 6 1．3 1±0．2 8 0．4 0±0．0 8溫腎養(yǎng)血方（大） 1 0 2 3 8．9 6±1 8．5 7 1．4 2±0．2 4 0．4 0±0．0 6溫腎養(yǎng)血方（中） 1 0 2 4 3．9 0±1 0．7 1 1．3 4±0．2 0 0．4 2±0．0 7溫腎養(yǎng)血方（?。? 0 2 3 4．4 7±1 4．9 0 1．3 6±0．2 0 0．4 0±0．0 5

3．3 各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)比較 正常組大鼠卵巢組織明顯增大，部分卵巢表面有紅斑，各級(jí)生長(zhǎng)發(fā)育都可見(jiàn)，卵泡數(shù)目較多，可見(jiàn)不同發(fā)育期卵泡及優(yōu)勢(shì)卵泡，未見(jiàn)囊性擴(kuò)張卵泡。卵巢表現(xiàn)出較多黃體，說(shuō)明卵巢已有排卵。模型組及溫腎養(yǎng)血方小劑量組卵巢體積較小，卵巢表面蒼白，無(wú)斑點(diǎn)，色澤蒼白，卵泡數(shù)目少，卵泡較小，且形狀不規(guī)則，多呈囊性擴(kuò)張，內(nèi)含大量漿液性物質(zhì)，腔內(nèi)無(wú)卵丘及卵細(xì)胞，卵泡壁顆粒層細(xì)胞稀疏，層次明顯減少，無(wú)黃體。西藥組大鼠卵巢可見(jiàn)不同發(fā)育期卵泡，體積雖大但形狀不規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較紊亂，周?chē)该鲙Ш癖〔痪鶆颍w粒細(xì)胞層次減少，少量黃體形成。黃體細(xì)胞排列松散紊亂。溫腎養(yǎng)血方大、中劑量組大鼠卵巢的結(jié)構(gòu)明顯改善，多數(shù)卵巢可見(jiàn)發(fā)育期的各級(jí)卵泡，擴(kuò)張卵泡的顆粒層增厚，卵泡發(fā)育，卵泡內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)卵丘、卵細(xì)胞及典型黃體形成，黃體細(xì)胞大而圓，胞漿豐富。間質(zhì)腺較模型組明顯增多。見(jiàn)圖1。

4 討論

王冰曰：“腎氣全盛，沖任脈通，經(jīng)血漸盈，應(yīng)時(shí)而下，沖為血海，任主胞胎，二脈相資，故能有子。”腎陰癸水是經(jīng)血的物質(zhì)基礎(chǔ)，血是月經(jīng)的主要成分。腎氣封藏有度，肝氣疏泄有序，經(jīng)血通過(guò)經(jīng)脈，匯于血海，達(dá)于胞宮，血充氣暢，應(yīng)時(shí)而下。沖任二脈隸屬肝腎，肝藏血，腎藏精，乙癸同源，精血互生，脾統(tǒng)血，為后天之本，氣血生化之源。女子又以肝為先天，以血為本。溫腎養(yǎng)血方中淫羊藿、肉蓯蓉、鹿角溫補(bǔ)腎陽(yáng)，且溫而不燥，潤(rùn)而生精；女貞子、覆盆子、枸杞子、山茱萸、菟絲子滋補(bǔ)肝腎之陰，同時(shí)取“陰中求陽(yáng)”之意；柴胡、木香、香附疏肝解郁理氣；丹參、赤芍、生蒲黃、雞血藤、紅花、當(dāng)歸、益母草補(bǔ)血活血，疏通經(jīng)脈，化瘀生新；劉寄奴、蘇木祛瘀通絡(luò)；牛膝引藥下行，走而能補(bǔ)，使氣血得以暢行。以上諸藥意在補(bǔ)肝腎之精，使氣舒精足血暢，卵子成熟排出，月經(jīng)如期而至，以攝精成孕。

卵泡的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，從原始卵泡開(kāi)始發(fā)育到優(yōu)勢(shì)卵泡的形成需要大約1年的時(shí)間。依次經(jīng)過(guò)始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡及排卵前卵泡4個(gè)階段。無(wú)排卵多表現(xiàn)為卵泡在排卵前的閉鎖。Flerko等［5］認(rèn)為卵泡膜毛細(xì)血管血流量的減少在導(dǎo)致大多數(shù)卵泡于竇前期閉鎖中發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí)，與正常婦女相比，不孕癥患者卵巢動(dòng)脈舒張期血流呈高阻抗、無(wú)成熟卵泡且卵巢甾體激素變化無(wú)規(guī)律，提示卵泡發(fā)育障礙、無(wú)排卵及不育患者存在卵巢血液供應(yīng)障礙，且生殖器官血液供應(yīng)與卵泡發(fā)育和生殖內(nèi)分泌水平密切相關(guān)［6－7］。溫腎養(yǎng)血方于補(bǔ)腎藥物中配伍大劑量的補(bǔ)血活血藥物，其促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用機(jī)制可能與促進(jìn)卵巢局部血液循環(huán)，影響卵巢的旁分泌和自分泌功能有關(guān)。方中雞血藤，陸象咸云：“曾見(jiàn)婦人合藥服之，多年不育者，后皆有子?！保ā侗静菥V目拾遺》）《本草綱目》曰：“澤蘭走血分，故能治水腫，涂癰毒，破瘀血，消癥瘕，而為婦人要藥。”藥理學(xué)研究［8］表明，澤蘭水煎劑能對(duì)抗體外血栓形成，有輕度抑制凝血系統(tǒng)與增強(qiáng)纖溶活性的作用?！侗静菝审堋分^蒲黃“味甘，氣平，無(wú)毒，血病必用，消瘀血凝積、癥瘕崩帶殊功，調(diào)女人月候不勻，去產(chǎn)婦兒枕作痛”。藥理學(xué)研究表明，蒲黃水浸液、煎劑或50%乙醇浸液均有促進(jìn)凝血作用，且作用顯著而持久。蒲黃多種制劑能夠降低血壓、減輕心臟負(fù)荷，增加冠脈血流量，改善微循環(huán)，提高機(jī)體耐低氧能力，減輕心肌缺血性病變?！侗静輦湟分^牛膝“補(bǔ)肝腎，瀉惡血?！薄端幮越狻吩唬骸耙婺副竟χ窝?，故入諸陰之經(jīng)。行血而不傷新血，養(yǎng)血而不滯瘀血，所以為胎產(chǎn)圣藥。”藥理學(xué)研究［9］表明，丹參能改善血液流變性，降低血液黏度，抑制血小板和凝血功能，激活纖溶，對(duì)抗血栓形成。本方中配伍羌活、細(xì)辛兩味辛溫藥物，頗有深意。隋·巢元方《諸病源候論·婦人雜病諸候》中認(rèn)為，女子不孕有內(nèi)外兩方面因素。內(nèi)因是勞傷氣血，正虛方使邪氣有機(jī)可乘，“婦人挾疾無(wú)子，皆由勞傷血?dú)猓錈岵徽{(diào)，而受風(fēng)寒客于子宮，致使胞內(nèi)生病，或月經(jīng)澀閉，或崩血帶下，致陰陽(yáng)之氣不和，經(jīng)血之行乖候，故無(wú)子”。外因是六淫邪氣直中胞宮?！白优K冷無(wú)子者，由將攝失宜，飲食不節(jié)，乘風(fēng)取冷，或勞傷過(guò)度，致風(fēng)冷之氣乘其經(jīng)血，結(jié)于子臟，故使無(wú)子”。認(rèn)為風(fēng)寒之邪入內(nèi)客于胞宮，可致宮寒。血得寒則凝結(jié)，沖任、胞宮受損，導(dǎo)致月水不利或不通，則不能攝精成孕。指出正氣虧虛、風(fēng)寒外侵是導(dǎo)致宮寒不孕的病機(jī)。因此，溫腎養(yǎng)血方中配伍祛風(fēng)散寒的羌活、細(xì)辛可以去除沉疴痼疾，鼓動(dòng)“腎間動(dòng)氣”，打通沖任二脈?！侗静萁?jīng)疏》曰：“羌活性溫，味辛、苦，氣厚于味，浮而升，陽(yáng)也。手足太陽(yáng)行經(jīng)風(fēng)藥，并入足厥陰、少陰經(jīng)氣分。女子疝瘕者，寒濕乘虛中腎家所致也，苦能燥濕，溫能澼寒，辛能發(fā)散，寒濕去而腎臟安，故主女子疝瘕，及療諸賊風(fēng)，百節(jié)痛風(fēng)無(wú)久新也?！笔Y昌烈［10］臨床發(fā)現(xiàn)，不論何部位，只要在活血化瘀藥中加入細(xì)辛，可增強(qiáng)鎮(zhèn)痛與活血逐瘀作用。其曾對(duì)照觀察四肢骨折、脫位及身體各部位軟組織損傷之腫痛較重者55例，加用細(xì)辛者較單用活血化瘀藥者疼痛減輕快，瘀腫消退快。

本研究結(jié)果表明，模型復(fù)制后大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化，大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)明顯降低（P＜0．05）。各治療組大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)較模型組無(wú)明顯變化（P＞0．05），可能與樣本量小有關(guān)。有研究［11］表明，丹參具有促進(jìn)卵泡發(fā)育和減少細(xì)胞凋亡的作用，能夠提高卵泡存活率。文獻(xiàn)［12］報(bào)道淫羊藿可增加小鼠子宮質(zhì)量。肉蓯蓉能增強(qiáng)下丘腦－垂體－卵巢的促黃體功能，使大鼠子宮質(zhì)量比對(duì)照組明顯增加［11］。菟絲子、紅花、丹參、肉蓯蓉等中藥可提高血清雌激素水平，但淫羊藿、女貞子、川牛膝可使血清雌激素水平有所下降［13］。以上這些研究提示，中藥復(fù)方作用機(jī)制和靶點(diǎn)可能是復(fù)雜的、綜合的、系統(tǒng)的，中藥復(fù)方的各種成分一起作用維持機(jī)體平衡，達(dá)到陰陽(yáng)平衡，單一研究某種藥物的作用機(jī)制尚不能完整清楚地闡明中藥復(fù)方的作用機(jī)制。

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