咳喘停貼劑穴位貼敷對慢性哮喘大鼠肺組織抑炎細胞因子的影響

劉蘭英，喬 明，周 媛，高 峰，王和生，滕鳳猛

（1．江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2．連云港市中醫(yī)院，江蘇 連云港 222001；3．南京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210029）

慢性氣道炎癥是支氣管哮喘復發(fā)的主要病理機制之一，其中輔助性 T細胞1（T－h(huán)elper 1，Th1）產(chǎn)生以干擾素－γ（interferon－γ，IFN－γ）、白細胞介素－2（interleukin－2，IL－2）、IL－12等為代表的抑炎細胞因子，導致慢性氣道炎癥加重［1］。吸入含有糖皮質(zhì)激素的復方制劑是目前主要治療方法之一，能在一定程度上改善癥狀，但仍然不能有效緩解其復發(fā)的頻率和程度。中醫(yī)學認為該病屬于“哮喘”“哮證”“喘鳴”“呷嗽”等范疇。王執(zhí)中《針灸資生經(jīng)》云：“因與人治哮喘，只繆肺俞，不繆他穴”，為背俞穴治療哮喘開辟了先河。

筆者前期研究［2］發(fā)現(xiàn)，咳喘停貼劑可能通過降低慢性哮喘模型大鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）中促炎細胞因子IL－6、IL－13的含量來發(fā)揮抗炎作用，其作用與布地奈德、地塞米松相當。本研究擬通過復制慢性過敏性哮喘大鼠模型，觀察咳喘停貼劑穴位貼敷對 Th1相關(guān)抑炎細胞因子IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影響，并與地塞米松、布地奈德的作用比較，從而探討該貼劑改善慢性氣道炎癥的可能作用機制。

1 材料

1．1 動物 SPF級雄性Wistar大鼠48只，上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008－0016，6周齡，體質(zhì)量（160±20）g，在室溫18～22℃、濕度28%的環(huán)境中飼養(yǎng)1周后使用。

1．2 儀器 魚躍402AI型超聲霧化器：江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司；非完全密閉玻璃箱（30cm×40 cm×50cm）：自制；Olympus BX－51型病理圖像采集系統(tǒng)：日本奧林巴斯公司；240351型BioTek酶標儀：美國伯騰儀器有限公司。

1．3 試劑 卵蛋白（ovalbumin，OVA）：純度≥98%，美國sigma公司；氫氧化鋁（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；地塞米松磷酸鈉注射液（容量1mL，含藥5mg）：山西晉新雙鶴藥業(yè)；布地奈德混懸液（容積2mL，含藥1mg）：阿斯利康制藥有限公司；IFN－γ試劑盒（批號 KGERC101g）、IL－2試劑盒（批號 KGER028）、IL－12試劑盒（批號 KGER036）：均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1．4 藥物 咳喘停貼劑：由南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑部制備。藥物組成：白芥子、生甘遂、細辛、延胡索、麻黃、肉桂等9味中藥，分別打粉過200目篩，按一定比例混合后加生姜汁、凡士林做成直徑1cm，質(zhì)量約為0．3g的丸劑，置于5cm×5cm膠布上的貼劑。假貼劑：面粉加同上比例的生姜汁、凡士林做成直徑1cm，質(zhì)量約為0．3g的丸劑，置于5cm×5cm膠布上的貼劑。地塞米松磷酸鈉注射液：每支5mg。布地奈德霧化混懸液：每支1mg。

2 方法

2．1 實驗分組 48只大鼠，稱質(zhì)量后被隨機分成6組，分別為：正常組、模型組、穴位假貼敷組、布地奈德組、地塞米松組、穴位貼敷組。每組8只大鼠。

2．2 慢性哮喘大鼠模型復制 參考Palmans等的方法［3］制備OVA致敏慢性哮喘氣道炎癥大鼠模型。從第1天首次接受OVA注射，至第14天為致敏階段。第15～56天為持續(xù)激發(fā)階段（6周）。致敏階段：第1天予大鼠（正常組除外）腹腔注射OVA和氫氧化鋁混合溶液1mL（含OVA 10mg、氫氧化鋁100mg）；第8天再次腹腔注射加強致敏。激發(fā)階段：第15天開始，將大鼠置于自備密閉霧化箱內(nèi)，予1%OVA溶液霧化吸入，每次30min，隔日1次。其間觀察大鼠是否出現(xiàn)噴嚏，及其呼吸、口唇、腹部及活動度的異常反應，直到第56天霧化結(jié)束。

2．3 分組治療 從第57天起，對正常組和模型組以外的大鼠進行治療。布地奈德組：布地奈德166．67mg／m3霧化吸入30min，共治療14d。地塞米松組：每只大鼠腹腔注射地塞米松1mg／kg，每日1次。穴位假貼敷組：假貼劑貼敷于雙側(cè)肺俞、脾俞、腎俞穴（取穴方法參考李忠仁主編的《實驗針灸學》［4］），在穴區(qū)脫毛后將藥丸壓成直徑約1cm圓餅狀，用膠布固定到穴位上，6h后去除，每日1次，共治療14d［5］。穴位貼敷組：咳喘停貼劑貼敷于上述穴位，方法同上。正常組：正常喂養(yǎng)不做其他處理。模型組：模型復制后正常喂養(yǎng)，不做其他處理。

2．4 觀察指標及方法

2．4．1 慢性哮喘模型大鼠行為學評價 觀察慢性哮喘模型大鼠活動度、毛發(fā)情況；霧化激發(fā)時是否出現(xiàn)典型哮喘樣發(fā)作：如呼吸急促，張口喘息，噴嚏，口唇發(fā)紺，前肢縮抬，點頭呼吸，腹部翕動及行動遲緩等。

2．4．2 肺組織形態(tài)學觀察 大鼠用10%水合氯醛（3．5mL／kg）腹腔注射麻醉后，無菌操作皮膚，打開胸腔，夾閉其右主支氣管，從氣管緩緩注入生理鹽水4mL灌洗左肺，反復3次，收集BALF，離心（2 000～3 000r／min），取其上清液并進行分裝檢測。取右肺中葉，在4℃生理鹽水中漂洗干凈，立即投入10%甲醛溶液中固定24h，石蠟包埋，切片，蘇木精－伊紅（hematoxylin－eosin，HE）染色，觀察肺組織形態(tài)學變化。

2．4．3 BALF中促炎細胞因子含量 ELISA法測定大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量，按試劑盒說明書進行操作。

2．5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標準差（±s）”進行統(tǒng)計學描述。由于這是單因素非均衡設計的組合實驗，按研究目的拆分成2個組合。①正常組和模型組：均數(shù)比較采用兩個獨立樣本t檢驗。②模型組、穴位假貼敷組、布地奈德組、地塞米松組、穴位貼敷組：多組間均數(shù)比較，采用單因素方差分析；組間均數(shù)多重比較，采用LSD檢驗（方差齊時）或Dunnett'sT3檢驗（方差不齊時）。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3．1 慢性哮喘模型大鼠行為學評價 正常組大鼠活動正常，無喘促等表現(xiàn)。模型組大鼠表現(xiàn)為毛發(fā)暗淡、豎毛、倦怠。霧化激發(fā)時部分大鼠出現(xiàn)典型哮喘樣發(fā)作，如呼吸急促，喘息，點頭呼吸，腹部翕動，行動減少，并隨著激發(fā)次數(shù)增加癥狀逐步加重。部分大鼠出現(xiàn)陣發(fā)性噴嚏，隨著激發(fā)次數(shù)增加噴嚏次數(shù)增加。

3．2 肺組織形態(tài)學觀察 正常組大鼠肺泡形態(tài)規(guī)則，肺間質(zhì)有少量炎性細胞浸潤。模型組大鼠肺泡腔縮小，其內(nèi)見炎性細胞浸潤及黏液栓，肺間質(zhì)增厚，可見大量炎性細胞浸潤。穴位假貼敷組與模型組大鼠相似，肺泡腔縮小，其內(nèi)見炎性細胞浸潤及黏液栓，肺間質(zhì)增厚，可見大量炎性細胞浸潤。布地奈德組與模型組大鼠比較，支氣管腔內(nèi)黏液栓減少，肺間質(zhì)增厚，可見炎性細胞浸潤。地塞米松組與模型組大鼠比較，可見肺大泡、肺泡內(nèi)黏液栓明顯減少，肺間質(zhì)略增厚。穴位貼敷組與模型組大鼠比較，可見部分肺大泡、肺泡腔內(nèi)少量黏液栓，肺間質(zhì)略增厚，其內(nèi)有少量炎性細胞浸潤。見圖1。

3．3 模型因素對大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影響 與正常組比較，模型組大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量均顯著降低（P＜0．05）。說明模型因素對大鼠 BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量具有明顯影響。見表1。

3．4 藥物干預對慢性哮喘模型大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影響 穴位假貼敷組與模型組BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；與模型組比較，布地奈德組、地塞米松組、穴位貼敷組大鼠BALF中IFN－γ、IL－12含量均顯著升高（P＜0．05），IL－2含量呈升高趨勢（P＞0．05）。布地奈德組、地塞米松組、穴位貼敷組3組之間IFN－γ、IL－2、IL－12含量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。見表2。

表1 模型因素對大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影響（±s）

表1 模型因素對大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影響（±s）

注：與對照組比較，＃P＜0．05。

組別 n I F N－γ／（p g／m L）I L－2／（p g／m L）I L－1 2／（p g／m L）正常8 6 2．6 1±6．6 3 5 8．2 2±1 0．3 1 1 4．8 6±4．2 2模型 8 4 4．6 6±8．4 0＃ 3 2．9 4± 7．2 4＃ 5．8 6±1．9 4＃

表2 藥物干預對慢性哮喘大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影響（±s）

表2 藥物干預對慢性哮喘大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影響（±s）

注：同列具有相同右上標符號的組別相比較，P＞0．05；同列不含相同右上標符號的組別相比較，P＜0．05。

組 別 n IFN－γ／（pg／mL）IL－2／（pg／mL）IL－12／（pg／mL）模 型 8 44．66±8．40＃ 32．94± 7．24＃ 5．86±1．94＃穴位假貼敷 8 40．08±4．98＃ 33．08± 6．08＃ 5．35±1．78＃布地奈德 8 53．01±6．28△ 45．27±10．08＃ 9．73±2．01△地塞米松 8 54．11±7．11△ 46．31±13．32＃ 9．25±2．76△穴位貼敷 8 52．13±9．46△ 46．55±16．78＃ 8．54±1．73△

4 討論

前期研究［6－7］發(fā)現(xiàn)，咳喘停貼劑穴位貼敷治療慢性哮喘，可通過增加Th1相關(guān)T－bet mRNA的表達，降低Th2相關(guān)GATA－3mRNA的表達來調(diào)節(jié)Th1／Th2的失衡，從而起到改善慢性氣道炎癥的作用，其作用與地塞米松相似。IFN－γ可抑制IL－4誘導IgE的合成，參加哮喘的速發(fā)性和遲發(fā)性變態(tài)反應。馮梅晶等［8］發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘急性發(fā)作患兒吸入IFN－γ聯(lián)合口服孟魯司特鈉，可快速緩解癥狀，減輕氣道炎癥。謝海棠等［9］發(fā)現(xiàn)哮喘患兒IFN－γ水平及第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）明顯低于健康兒童，IFN－γ水平與FEV1成正相關(guān)。薛濤［10］研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒血清中IL－2顯著低于健康兒童，予支氣管擴張劑及糖皮質(zhì)激素治療后IL－2明顯升高。

本研究采用的咳喘停貼劑為江蘇省中醫(yī)院針灸康復科治療支氣管哮喘的經(jīng)驗方［11］，由《張氏醫(yī)通》中白芥子貼結(jié)合小青龍湯加減而成。在前期研究［12］中發(fā)現(xiàn)，在三伏天對小兒哮喘緩解期用穴位貼敷治療可有效改善其復發(fā)情況。白芥子貼首見于清代張璐《張氏醫(yī)通·諸氣門下·喘》：“冷哮……夏月三伏中，用白芥子涂法，往往獲效?！痹摃刑岢霭捉孀淤N由四味中藥組成：白芥子、生甘遂、細辛、延胡索。茍曉紅［13］用白芥子散穴位貼敷背俞穴治療支氣管哮喘，治療后1年內(nèi)患者復發(fā)情況較治療前明顯改善。甘遂水煎劑可提高免疫復合物與巨噬細胞的結(jié)合能力，且表現(xiàn)出量效關(guān)系［14］。延胡索中所含的延胡索乙素等成分可解除支氣管痙攣，促進滲出物吸收［15］。李亞男等［16］發(fā)現(xiàn)細辛、白芥子、甘遂等成分對延胡索乙素經(jīng)皮滲透有顯著促進作用。小青龍湯具有解表化飲、止咳平喘之功［17］。本方中麻黃乃“喘家圣藥”，性溫，味辛，歸肺經(jīng)，為君藥，可宣肺平喘；桂枝性溫，味辛甘，歸肺經(jīng)，為臣藥，可調(diào)和營衛(wèi)；細辛性溫，味辛，歸肺經(jīng)，為佐藥。研究證實，小青龍湯能夠改善氣道炎癥，調(diào)節(jié)IL－4和IFN－γ的比例失衡［18］。麻黃的水提物及其醇提物有降低血清溶血素、抗變態(tài)反應及抗補體作用，其有效成分麻黃堿，具有舒張支氣管平滑肌、解除支氣管痙攣的作用［19］。細辛含揮發(fā)油甲基丁香酚，具有抗炎、抗組胺、抑制IL－2受體表達，對豚鼠氣管有明顯的松弛作用，可緩解豚鼠哮喘發(fā)作時氣道的痙攣［20］。

中醫(yī)學認為，慢性哮喘多為“冷哮”，宿痰內(nèi)伏于肺，復加各種原因，引動肺內(nèi)伏痰，肺氣上逆而致哮喘。患者可見反復發(fā)作的咳喘、痰鳴、氣短、疲乏、自汗、脈虛無力等，其主要病位在肺，連及脾腎兩臟。因此，其治療應補益肺、脾、腎三臟陽氣以治其本，宣肺化痰平喘以治其標。劉立公等［21］通過檢索古醫(yī)籍中膀胱經(jīng)腧穴的主治功能，發(fā)現(xiàn)膀胱經(jīng)經(jīng)穴具有宣肺散寒、壯腎利尿之功。劉夢琳［22］通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，艾灸背部膀胱經(jīng)穴位對喘證具有好的療效。

本研究顯示，穴位貼敷可使慢性哮喘大鼠BALF中IFN－γ、IL－12含量明顯升高（P＜0．05），IL－2含量呈現(xiàn)升高趨勢（P＞0．05），其作用明顯優(yōu)于穴位假貼敷療法，且與布地奈德、地塞米松的作用相當。說明穴位貼敷可通過增加氣道抑炎因子IFN－γ、IL－12含量來改善慢性氣道炎癥。

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