氨溴索對(duì)胃內(nèi)容物吸入性肺損傷JNK信號(hào)通路的影響

氨溴索對(duì)胃內(nèi)容物吸入性肺損傷JNK信號(hào)通路的影響

張衍民賈曉民趙杰李海泉馬雷徐俊馬杭文璐

(徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科江蘇徐州221006)

[摘要]①目的探討氨溴索對(duì)大鼠胃內(nèi)容物吸入后損傷肺組織中c-氨基末端蛋白激酶(c-jun N-terminal kinases，JNK)信號(hào)通路的影響。②方法40只健康Sprague-Dawley雄性大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、損傷組、SP600125(JNK特異性阻斷劑)組、氨溴索組，每組10只；復(fù)制大鼠胃內(nèi)容物吸入性肺損傷動(dòng)物模型。檢測(cè)各組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與丙二醛(MDA)活性、肺組織濕重/干重比(W/D)、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性變化。Western-blot方法檢測(cè)肺組織中JNK、磷酸化JNK(p-JNK)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表達(dá)；光鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化。③結(jié)果與對(duì)照組比較，損傷組BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與MDA活性、肺組織濕重/干重(W/D)比值以及MPO活性增加(均P<0.05)；p-JNK與iNOS蛋白表達(dá)均顯著增高(均P<0.05)；肺組織出現(xiàn)明顯病理組織學(xué)損傷。與損傷組比較，SP600125組和氨溴索組BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與MDA活性、肺組織W/D比值以及MPO活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；p-JNK與iNOS蛋白表達(dá)均顯著下降(均P<0.05)；肺組織病理學(xué)損傷減輕。Western-blot結(jié)果顯示各組大鼠肺組織中JNK蛋白表達(dá)無差異。④結(jié)論JNK參與胃內(nèi)容物吸入性肺損傷炎癥反應(yīng)，氨溴索可能通過抑制JNK信號(hào)通路、抑制iNOS表達(dá)發(fā)揮抗炎、抗氧化保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]氨溴索肺損傷JNK

[中圖分類號(hào)]R 563

【作者簡(jiǎn)介】張衍民(1980-)，男，主治醫(yī)師。研究方向：急性肺損傷發(fā)病機(jī)制。

【通訊作者】趙杰。

Effect of ambroxol inhalation lung injury of JNK signaling pathway in gastric aspiration lung injurZHANGYanmin,JIAXiaomin,ZHAOJie,etal(DepartmentofRespiratoryMedicineSecondAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,JiangsuXuzhou221006,China)

ABSTRACT[]ObjectiveTo investigate effect of ambroxol hydrochloride inhalation lung injury in tissue of c- N-terminal protein kinase signal pathway in Gastric Aspiration lung Injury.Methods40 healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups: control group,injury group,SP600125(JNKspecific inhibitor) group,ambroxolgroup,10 rats in each group;rat ofaspiration of gastric contents of lung injuryanimal model was remolded.Bronchoalveolarlavage fluidof rats(BALF) neutrophil count and malondialdehyde(MDA)activity,the lung wet weight /dry weight ratio(W/D),myeloperoxidase(Myeloperoxidase,MPOactivity changes.Detection of lung tissue Western-blot method of JNK and p-JNK(phosphorylated JNK)and inducible nitric oxidesynthase(iNOS)protein expression;observe the lung tissue structure changesunder light microscope.ResultsCompared with the control group,injury neutrophil count and MDA ingroup BALF(MDA)activity of neutral,lung wet weight/dry weight ratio,MPO activity increased(P<0.05)p-JNK and iNOS protein expression were significantly increased(P<0.05);lung tissue appeared obvious histopathological injury.Compared with the injury group,SP600125group andambroxol group BALF neutrophil count and malondialdehyde(MDA)activity,lung wetweight/dry weight ratio and the activity of MPO decreased,the difference was statistically significant(P<0.05);p-JNKand iNOS protein expression were significantly decreased(P<0.05);Damage of the lung tissue pathology was reduced.Western-blot results showed that thelung tissue of rats in each group were no difference in the expression of JNK protein.ConclusionJNK is involved in gastric contents inhalation lung injury and inflammation reaction,the protective effect of ambroxol on anti-inflammatory,antioxidant may be related to the inhibition of JNK signaling pathway and the inhibition of iNOS expression.

[KEYWORDS]Ambroxol.Lung injury.JNK

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)很容易發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，ALI/ARDS的發(fā)病及肺保護(hù)機(jī)制一直是重癥呼吸關(guān)注的主要方面[1,2]。引起ALI/ARDS的病因是多種多樣的，而胃內(nèi)容物吸入作為化學(xué)性因素之一，在國外的報(bào)道中占發(fā)病的首位。呼吸?？漆t(yī)師面臨著胃腸反流疾病、肥胖高腹壓、醉酒狀態(tài)及各種腦血管疾病發(fā)生后并發(fā)誤吸、反流等引起的肺損傷問題。所以，積極探索胃內(nèi)容物吸入性肺損傷發(fā)病及其保護(hù)機(jī)制有著重要的臨床意義。

研究發(fā)現(xiàn),c-氨基末端蛋白激酶(c-jun N-terminal kinases，JNK)作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)通路之一，在細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到重要作用，參與內(nèi)毒素血癥誘發(fā)的肺損傷細(xì)胞生物學(xué)炎癥反應(yīng)[3];氨溴索具有化痰、抗炎、抗氧化及促進(jìn)肺表面活性物質(zhì)合成等作用[4]，在胃內(nèi)容物吸入性肺損傷中具有抗炎保護(hù)作用[5,6]。本研究旨在建立大鼠胃內(nèi)容物吸入性肺損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)一步研究氨溴索對(duì)JNK信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300g(由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；氨溴索購于德國勃林格殷格翰公司；丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)檢測(cè)試劑盒由南京建成生化試劑公司提供；磷酸化JNK、p-JNK及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體、JNK抑制劑SP600125為Promega公司產(chǎn)品。

1.2模型的建立及分組SD大鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只。對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物僅進(jìn)行氣管插管，氣道內(nèi)給予等量生理鹽水滴入。損傷組：采用Krishnan等動(dòng)物模型[7]，使用3%戊巴比妥鈉，50mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉動(dòng)物，給予14G靜脈導(dǎo)管行氣管插管術(shù)，通過氣管插管向氣道內(nèi)滴入胃內(nèi)容物(劑量為1.2mL/kg，成分包含40mg/mL胃食物微粒，pH值1.25；制備：取正常飼養(yǎng)大鼠予生理鹽水灌胃，灌洗物通過薄紗濾過，將其pH值調(diào)定為1.25)。損傷發(fā)生后24h處死大鼠并取材。SP600125組：術(shù)前給予尾靜脈注射JNK特異性抑制劑SP600125(3mg/100g),其余步驟同損傷組。氨溴索組：損傷發(fā)生后2h尾靜脈注射氨溴索(50mg/kg)，其余步驟同損傷組。

1.3取材及制備標(biāo)本開胸取出肺組織，取右上葉肺用于病理學(xué)檢查；取右中葉肺稱重；剩余右肺制成肺組織勻漿液：按每100mg肺組織加入0.9mLPBS(pH7.4)，在冰浴下用組織勻漿器制成10%肺組織勻漿。肺組織勻漿液分別于4℃、3000r/min離心15min，取上清于-80℃凍存。左肺予4℃生理鹽水灌洗，灌洗回收率>85%；左肺組織充分漂洗后置于液氮中保存供蛋白免疫印跡法檢測(cè)。

1.4檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1大鼠肺泡灌洗液(BALF)。中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)。MDA活性檢測(cè)按照試劑盒說明進(jìn)行，并于最大吸收峰532nm處測(cè)定吸光度。

1.4.2肺組織濕/干重(W/D)比測(cè)定。取右中葉肺組織稱重后置于烤箱中，70℃烘烤至恒重后稱干重，計(jì)算肺組織W/D。

1.4.3肺組織MPO活性變化測(cè)定。用四甲基聯(lián)苯胺法測(cè)定肺組織MPO活性，以每克組織中MPO活性單位(U/g)表示。

1.4.4Western Blot檢測(cè)肺組織JNK、p-JNK、iNOS蛋白表達(dá)。自液氮中取出標(biāo)本，迅速置于冰勻漿緩沖液中冰浴，用Teflon勻漿器高速勻漿(10s×6次)，800r∕min，離心10min，取上清為細(xì)胞蛋白提取液。按改良Lowry法測(cè)定其蛋白濃度，牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。取相同蛋白量(100μg)的樣品經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，電轉(zhuǎn)條件2.5mA/cm2，電轉(zhuǎn)時(shí)間50min；轉(zhuǎn)移完畢，加入封閉液，室溫封閉1h；封閉后，加入用封閉液稀釋的一抗4℃孵育過夜；使用washing buffer〔10 mmol/L Tris(pH7.4)，0.1mol/L NaCl，0.05%Tween-20〕洗膜3次，加入熒光二抗(兔抗鼠IgG-AP)室溫?fù)u床上孵育2h；washing buffer洗膜后顯色。結(jié)果使用Image軟件半定量分析。

1.4.5病理學(xué)觀察。取右上葉肺組織用10%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色后，光鏡下觀察病理學(xué)變化。

2結(jié)果

2.1各組大鼠肺組織BALF中(WBC)、MDA活性、W/D比值、MPO活性比較與對(duì)照組比較，損傷組BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與MDA活性、W/D比值以及MPO活性增加(均P<0.05)；與損傷組比較，SP600125組和氨溴索組BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與MDA活性、肺組織W/D比值以及MPO活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表1。

表1　各組大鼠肺組織BALF中WBC、MDA活性、W/D比值、MPO活性比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與損傷組比較，#P<0.05

2.2各組大鼠肺組織JNK、p-JNK、iNOS蛋白表達(dá)Western-blot結(jié)果顯示各組大鼠肺組織中JNK蛋白表達(dá)無差異；與對(duì)照組比較，損傷組中p-JNK與iNOS蛋白表達(dá)均顯著增高(均P<0.05)；與損傷組比較，SP600125組和氨溴索組中p-JNK與iNOS蛋白表達(dá)均顯著下降(均P<0.05)；見圖1、圖2、圖3及表2。

圖1JNK蛋白在對(duì)照組、損傷組、SP600125組、氨溴索組表達(dá)

圖2p-JNK蛋白在對(duì)照組、損傷組、SP600125組、氨溴索組表達(dá)

圖3iNOS蛋白在對(duì)照組、損傷組、SP600125組、氨溴索組表達(dá)

表2　各組肺組織JNK/β-actin和p-JNK/β-actin及iNOS/β-actin蛋白表達(dá)灰度比值

注：與對(duì)照組比較，aP>0.05，bP<0.05；與損傷組比較,cP<0.05

2.3病理學(xué)改變對(duì)照組肺組織無明顯病理學(xué)改變，肺泡間隔正常，未見明顯滲出、偶見少量炎性細(xì)胞；損傷組肺組織病理學(xué)改變明顯，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內(nèi)可見滲出、炎性細(xì)胞及肺泡內(nèi)出血表現(xiàn)；SP600125組與氨溴索組肺組織損傷較損傷組減輕，肺泡間隔有增厚但不如損傷組明顯，肺泡內(nèi)滲出減少，炎性細(xì)胞及肺泡內(nèi)出血減少。見圖4。

A. 對(duì)照組　B. 損傷組　C.SP600125組　D.氨溴索組

圖4光鏡下觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化(蘇木精-伊紅染色×100)

3討論

氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)在胃內(nèi)容物吸入性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。急性損傷發(fā)生后中性粒細(xì)胞的“呼吸爆發(fā)”可產(chǎn)生大量活性氧自由基，多種炎癥細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、氧化應(yīng)激因子的表達(dá)增多，同時(shí)機(jī)體抗氧化機(jī)制障礙存在，均會(huì)造成肺組織氧化/抗氧化系統(tǒng)嚴(yán)重破壞[8]。MDA是由氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物；肺組織W/D的變化可較好地反映肺間質(zhì)及肺泡血管通透性改變的程度；肺組織中的MPO活性在一定程度上反映中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集程度。與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，損傷組中BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與MDA活性、肺組織W/D比值以及MPO活性均明顯增加，說明胃內(nèi)容物吸入后肺組織發(fā)生了明顯的脂質(zhì)過氧化等炎癥反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn),JNK作為絲裂原活化蛋白激酶的主要成員之一，可參與炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。iNOS是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在組織中大量表達(dá)會(huì)造成NO與ONOO-增多，作為強(qiáng)氧化劑損傷肺組織[10]。本實(shí)驗(yàn)條件下,各組大鼠肺組織JNK蛋白表達(dá)無差異，而損傷發(fā)生后p-JNK表達(dá)增多；與損傷組比較發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用JNK特異性抑制劑干預(yù)后p-JNK表達(dá)減少，同時(shí)BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與MDA活性、肺組織W/D比值以及MPO活性均下降；光鏡下組織病理學(xué)較損傷組減輕；Western-blot顯示SP600125組iNOS蛋白表達(dá)下降。上述說明：①JNK參與了胃內(nèi)容物吸入后肺損傷炎癥反應(yīng)，其生物學(xué)活性是在其磷酸化狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)的；②抑制p-JNK表達(dá)在一定程度上可抑制胃內(nèi)容物吸入后肺損傷炎癥反應(yīng)；③抑制p-JNK表達(dá)可減少iNOS蛋白表達(dá)。

氨溴索已不單純作為化痰藥物在臨床上應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)大劑量氨溴索應(yīng)用于ALI/ARDS治療主要依賴于其抗氧化及抗炎作用[11]。本實(shí)驗(yàn)條件下，與損傷組比較，氨溴索組BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與MDA活性、肺組織W/D比值以及MPO活性下降；肺組織病理學(xué)損傷減輕；p-JNK與iNOS蛋白表達(dá)均顯著下降。上述說明：①氨溴索在胃內(nèi)容物吸入性肺損傷中具有抗炎性細(xì)胞聚集及抗脂質(zhì)過氧化作用；②氨溴索可抑制p-JNK及iNOS蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,在大鼠胃內(nèi)容物吸入性肺損傷動(dòng)物模型中，氨溴索可能通過抑制JNK信號(hào)通路減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用。至于氨溴索抑制JNK活化的確切分子機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Koh Y. Update in acute respiratory distress syndrome. J Intensive Care[E/OL].2014,2:2. doi:10.1186/2052-0492-2-2

[2]Force ADT,Ranieri VM,Rubenfeld GD,et al.Acute respiratory distress syndrome:the Berlin definition[J].JAMA,2012,307(23):2526-33

[3]Zhou E,Li Y,Wei Z,et al.Schisantherin A protects lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome in mice through inhibiting NF-κB and MAPKs signaling pathways[J].Int Immunopharmacol,2014,22(1):133-40

[4]Wu X1, Li S, Zhang J, et al. Meta-analysis of high doses of ambroxol treatment for acute lung injury/acute respiratory distress syndrome based on randomized controlled trials[J]. J Clin Pharmacol,2014,54(11):1199-206

[5]張衍民,賈曉民,趙杰,等.氨溴索對(duì)吸入性肺損傷大鼠肺組織PBEF表達(dá)的影響及其抗炎作用[J].國際呼吸雜志,2012,32(6):409-412

[6]張衍民,賈曉民,趙杰.氨溴索在大鼠胃內(nèi)容物吸入性肺損傷中的抗炎作用[J].臨床肺科雜志,2012,17(2):222-223

[7]Krishnan R, Bruce A, Alan O, et al. Predictive modeling and inflammatory biomarkers in rats with lung contusion and gastric aspiration[J].J Trauma, 2009, 67:1182-1190

[8]Bruce A. Davidson,R. Robert Vethanayagam,Melissa J. Grimm, et al. NADPH oxidase and Nrf2 regulate gastric aspiration-induced inflammation and acute lung injury[J].J Immunol,2013,190(4): 1714-1724

[9]Maniatis NA, Sfika A, Nikitopoulou I, et al. Acid-induced acute lung injury in mice is associated with P44/42 and c-Jun N-terminal kinase activation and requires the function of tumor necrosis factor α receptor I[J].Shock,2012,38(4):381-386

[10]Li w, Liu F, Wang C, et al. Novel insights into phosgene-induced acute lung injury in rats: role of dysregulated cardiopulmonary reflexes and nitric oxide in lung edema pathogenesis[J].Toxicol Sci,2013,131:612-628

[11]Wu X1, Li S, Zhang J, et al. Meta-analysis of high doses of ambroxol treatment for acute lung injury/acute respiratory distress syndrome based on randomized controlled trials[J].J Clin Pharmacol,2014,54(11):1199-206

(2015-05-25收稿)(岳靜玲編輯)

歡迎投稿歡迎訂閱