高效液相色譜法測定發(fā)芽麥粒中γ－氨基丁酸（GABA）含量

張志清 徐 杰 叢 軍 任 飛

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，雅安 625014）

高效液相色譜法測定發(fā)芽麥粒中γ－氨基丁酸（GABA）含量

張志清 徐 杰 叢 軍 任 飛

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，雅安 625014）

建立了一種測定發(fā)芽麥粒中γ－氨基丁酸（GABA）含量的HPLC方法，并對四川10個(gè)小麥品種中GABA含量差異及其發(fā)芽培養(yǎng)期間變化規(guī)律進(jìn)行了分析。采用FDNB（2，4－二硝基氟苯）為柱前衍生劑，色譜條件為：色譜柱 Luna C18（2）（150 mm×4.60 mm，5μm），乙腈 －0.02 mmol／L乙酸銨混合溶液為流動(dòng)相（V∶V＝15∶85），柱溫30℃，流速1.0 mL／min，測定波長320 nm。結(jié)果表明，在0.025 5～0.127 6μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系，最低檢出限1.081×10－5μg／mL，方法的平均加標(biāo)回收率為97%。采用建立的方法測定不同小麥品種在萌發(fā)12 h后的GABA含量在0.238～5.26 mg／100 g之間，不同品種間GABA的含量差異顯著，在萌發(fā)的0～12 h內(nèi)，GABA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在8 h時(shí)含量達(dá)到最高。

發(fā)芽麥粒 γ－氨基丁酸（GABA） 高效液相色譜法

γ－氨基丁酸（GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸和重要的神經(jīng)遞質(zhì)［1］，廣泛存在于植物和動(dòng)物體內(nèi)，具有抗焦慮［2］，抗氧化［3］和生殖生理作用［4］。GABA的制備主要有化學(xué)法、微生物法和植物富集法。然而前2種方法各有欠缺，化學(xué)法條件苛刻，耗能大，且有化學(xué)物質(zhì)的殘留；微生物法效率較高，但高產(chǎn)菌株難以獲得。有學(xué)者報(bào)道可通過基因工程的辦法來重組高產(chǎn)的大腸埃希氏菌富集GABA，但其能力仍不及通過植物富集的方法［6］。相比而言，植物富集方法優(yōu)勢在于成本低，條件也容易控制，得率較高，比較容易實(shí)施［7］。谷物類糧食中的蛋白質(zhì)被其內(nèi)在的蛋白酶水解后生成大量谷氨酸，在一定條件下可被谷氨酸脫羧酶催化轉(zhuǎn)化生成GABA，同時(shí)可以通過補(bǔ)充谷氨酸鈉等方法使谷物中GABA的含量大大提高［8］。麥粒在萌發(fā)的過程中，各種酶被活化，谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下不斷轉(zhuǎn)化為GABA，加之麥粒本身就含有一定的GABA，通過發(fā)芽富集能顯著提高 GABA的含量［9－10］。

目前，國內(nèi)外檢測GABA含量的方法主要有氨基酸自動(dòng)分析儀法、酶法、毛細(xì)管電泳法、比色法等。近年來隨著高效液相色譜儀的普及和其分辨率高、靈敏、精確的優(yōu)點(diǎn)，該法得到了廣泛應(yīng)用。由于GABA不能直接被檢測器捕獲，必須對其進(jìn)行衍生化處理，生成穩(wěn)定的化合物。常用柱前衍生劑有鄰苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（DNS）、氯甲酸芴甲酯（FMOC）、咔唑 －9－己基氯甲酸酯（CEOC）、2，4二硝基氟苯（FDNB）、異硫氰酸苯酯（PITC）［5］和 AQC（6－氨基喹啉基－N－羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯），但往往會(huì)因樣品類型不同而有所差異。本研究擬采用2，4二硝基氟苯（FDNB）作為柱前衍生劑，在高效液相色譜方法的基礎(chǔ)上建立一種穩(wěn)定、方便、準(zhǔn)確的方法，并以該法分析不同小麥品種在萌發(fā)時(shí)期GABA含量的變化，為利用小麥富集GABA積累參考依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥材料由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所提供的良麥2號、川農(nóng)16號、川麥10號、綿陽26號、川麥20號、川育6號、良麥4號、川麥22號、川育8號、川育16號共10個(gè)品種。

γ－氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、2，4－二硝基氟苯（FDNB）：美國Sigma公司；乙腈（色譜級）：美國Supelco公司；水為超純水。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Shimadzu10A高效液相色譜儀（配N2000色譜工作站）：日本Shimadzu公司；Mill－Q超純水儀：德國密理博公司；JY 92－IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜 柱：Luna C18（2）（150 mm × 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈：乙酸銨溶液（0.02 mmol／L）（V∶V）＝15∶85；流速：1.0 mL／min；檢測波長：320 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

1.3.2 樣品制備

準(zhǔn)確稱取精選后的小麥種子約3 g，用蒸餾水沖洗，然后用75%的酒精溶液浸泡5 min，最后用去離子水清洗，轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)皿中，并于30℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將麥粒放入研缽研磨，加入 50 mL乙醇 －水溶液（V∶V＝60∶40），在40℃下，超聲波提取2次，每次15 min，提取功率為300W。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮，衍生化處理，流動(dòng)相定容至25 mL，12 000 r／min離心10min，用孔徑為0.22μm的有機(jī)濾膜過濾，待測。

1.3.3 衍生化處理

在濃縮后的樣品處理液中添加0.5 mol／L NaHCO3（pH 9.0）溶液1 mL和1%FDNB的乙腈溶液1 mL，混勻，置于60℃水浴中1 h，注意避光，冷卻至室溫后用流動(dòng)相調(diào)至刻度，搖勻，12 000 r／min，離心10 min，取上清，濾膜過濾后備用。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取5 mg GABA標(biāo)樣，溶解于5 mL超純水，配制成100μg／mL的溶液，備用。取1 mL樣品衍生化處理，過濾。準(zhǔn)確吸取上述衍生化處理過的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取體積為 1、2.5、5、7.5、10、15μL注入高效液相色譜儀中，進(jìn)行色譜分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性評價(jià)

精確吸取處理過的10μL標(biāo)準(zhǔn)品和小麥樣品（良麥2號）在1.3.1的色譜條件下檢測。結(jié)果如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為18.723 min，理論塔板數(shù)n＝12 000，且峰型正常，無拖尾現(xiàn)象。樣品保留時(shí)間為18.818 min，峰底寬為0.417，樣品色譜分離中GABA色譜峰與最難分離組分的分離度為R＝1.54。說明該色譜條件下能夠有效的分離發(fā)芽麥粒中GABA。

圖1 GABA測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖

2.2 線性關(guān)系與檢測限

準(zhǔn)確吸取衍生化處理過的標(biāo)準(zhǔn)樣品，體積分別為 1、2.5、5、7.5、10、15μL，注入高效液相色譜儀中。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得GABA的回歸方程Y＝107X－693 98（r＝0.999 9）。結(jié)果表明 GABA進(jìn)樣量0.025 5～0.127 6μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，以基線噪聲的3倍計(jì)算最低檢出限為1.081×10－5μg／mL。

2.3 精密度試驗(yàn)

將處理后的0.10 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品10μL，連續(xù)反復(fù)進(jìn)樣5次，以峰面積考察其精密度，結(jié)果顯示GABA的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為小于1.2%。

表1 精密度試驗(yàn)測定結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取良麥2號小麥品種，按照樣品處理方法同時(shí)分別制備5份樣品溶液進(jìn)行測定，以GABA含量考察重復(fù)性，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%。證明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取處理過的標(biāo)準(zhǔn)液，分別于 0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，進(jìn)行GABA含量測定。由表3可知，GABA峰面積的RSD值為1.24%，表明GABA在8 h內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定。

表3 8 h內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)測定結(jié)果

2.6 回收率試驗(yàn)

稱取良麥2號小麥29.90、30.01和30.16 g麥粒，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，分別加入1.1、2.2和3.3 mg的GABA標(biāo)準(zhǔn)品（重復(fù)3次），按1.3.2制備樣品液，分別測定它們的平均回收率為110%、95%和86%，RSD分別為6.78%、5.46%和12.17%。其平均加標(biāo)回收率為97%。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)測定結(jié)果

2.7 樣品含量測定

按照本研究方法和色譜條件測定10個(gè)小麥品種中GABA的含量測定。將精選后的小麥種子用蒸餾水沖洗，當(dāng)小麥從燒杯中取出，75%的酒精溶液浸泡5 min，用去離子水清洗，轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)皿中，發(fā)芽期間種子濕潤狀態(tài)并防止種子部分接觸水面積時(shí)間較久而腐爛發(fā)臭，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，檢測結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，這些小麥材料中GABA含量在0.238～5.26 mg／100 g之間，并且不同的小麥品種間GABA的含量差異顯著。

表5 不同小麥品種GABA含量的測定結(jié)果

2.8 5種發(fā)芽麥粒中GABA含量變化分析

選取良麥2號，川農(nóng)16號，川麥10號，綿陽26號，川麥20號作為代表，利用所建立的方法分析5個(gè)小麥品種在萌發(fā)（0～12 h）的GABA含量變化規(guī)律。結(jié)果如圖2所示，良麥2號、綿陽26、川農(nóng)16、川麥10號等4個(gè)品種在萌發(fā)培養(yǎng)8 h時(shí)，GABA含量達(dá)到最高值。在麥粒萌發(fā)的過程中GABA含量的大體趨勢是先升高后降低，不同的小麥品種間，γ－氨基丁酸含量有較大差異。這可能是由于小麥在萌發(fā)初期，麥粒中內(nèi)源性蛋白酶和谷氨酸脫羧酶將蛋白質(zhì)水解并將其中的谷氨酸在脫羧積累產(chǎn)生γ－氨基丁酸，同時(shí)生成的γ－氨基丁酸在轉(zhuǎn)氨酶的催化下形成琥珀酸半醛不斷被消耗，在8 h后其中的谷氨酸基本消耗，而轉(zhuǎn)氨酶繼續(xù)水解γ－氨基丁酸，導(dǎo)致γ－氨基丁酸在8～12 h內(nèi)含量迅速下降。但川麥20號則是不斷降低的。這種不同品種類型間GABA含量的差異可能由于川麥20號發(fā)芽麥粒的組織中GAD活性的太低所致。根據(jù)上述規(guī)律可以對小麥等糧食作物進(jìn)行γ－氨基丁酸的富集，并對富集條件和富集時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，做到對γ－氨基丁酸的最大化富集，我國小麥品種多，因此，篩選出高γ－氨基丁酸合成能力的小麥品種也有助于采用小麥萌發(fā)來富集γ－氨基丁酸。

圖2 5種發(fā)芽麥粒中發(fā)芽過程中GABA的變化

3 討論

3.1 檢測方法的確定

文獻(xiàn)中GABA含量測定的報(bào)道中，主要有比色法、紫外分光光度法、氨基酸分析法和高效液相測定法。在前2種方法中，由于被檢測物質(zhì)的成分比較復(fù)雜，容易受到其他物質(zhì)的干擾，影響GABA的檢測，使檢測結(jié)果不夠精確。目前所采用的氨基酸分析法，在柱前或柱后衍生化后，大多數(shù)都用價(jià)格昂貴的熒光檢測器進(jìn)行測定。由于GABA不能直接用高效液相的方法進(jìn)行檢測，因此根據(jù)各個(gè)衍生劑的不同，檢測方法也有所差異。常用的方法有PITC法、DNS法、CEOC法、FDNB法和 OPA法［12］。前3種方法存在速度慢，反應(yīng)試劑容易干擾等問題，而OPA法因其衍生物穩(wěn)定性較差，試驗(yàn)效果不夠理想。FDNB能與GABA反應(yīng)生成穩(wěn)定的衍生物。該反應(yīng)速度快，不但能獲得較高檢測靈敏度還能較少其他物質(zhì)的干擾［13］。方法簡單易行等優(yōu)點(diǎn)，因此是一種理想的檢測方法。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究在色譜條件優(yōu)化中比較了不同的流動(dòng)相組合和色譜柱類型對分離效果的影響。首先選用了Hyperelone BDSC18柱（150 mm×4.6 mm，5μm色譜柱，甲醇－磷酸鹽作流動(dòng)相。流速在0.8～1.0 mL／min時(shí)。當(dāng)甲醇∶磷酸鹽≤83∶17時(shí)，保留時(shí)間雖短，但其理論塔板數(shù)不高，樣品中GABA的分離度達(dá)不到。采用同比例的甲醇和乙酸銨做流動(dòng)相.乙酸銨的比例越大，分離效果越好。但隨著相對保留時(shí)間延長，峰高下降，峰展寬加劇靈敏度降低［14］。選用乙腈∶乙酸銨 ＝15∶85，選用流速為1.0mL／min時(shí)，柱溫為30℃時(shí)，柱效（理論塔板數(shù)）可達(dá)4 400，明顯好于甲醇 －乙酸銨。當(dāng)選用Phenomenex LunaC18（2）（150 mm×4.60 mm，5μm）色譜柱時(shí)，理論塔板數(shù)達(dá)到12 000，分離效果明顯提高（圖1）。綜合考慮，選用乙腈－乙酸銨（15∶85）做檢測流動(dòng)相，流速為1.0 mL／min，柱溫為30℃，此時(shí)GABA留時(shí)間為18.723 min，因此，試驗(yàn)確定此流動(dòng)相為最佳流動(dòng)相配比。

3.3 樣品處理方法的優(yōu)化

GABA測定樣品處理的方法主要有索氏抽提法［15］，回流提取和震蕩提取3種方法，但3種方法都存在一定的不足。索氏抽提法在這3種方法中提取率最高，但其實(shí)際操作麻煩，且回流次數(shù)多，耗時(shí)長；回流提取法雖然操作起來較索氏抽提法方便，但其提取率要相對低一些，震蕩提取雖然簡單，但提取率在這3種方法中最低，且耗時(shí)更長，一般是12 h以上，本研究采取超聲波細(xì)胞破碎進(jìn)行提取，操作簡單，時(shí)間短，且提取次數(shù)少，提取率高。提取率隨提取溫度和提取功率的提高而上升，在滿足本試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，提取溫度為30℃，提取功率為300 W，提取2次，每次15 min，此時(shí)提取率可達(dá)97%以上。

3.4 不同小麥品種GABA含量的差異

用本方法測定良麥2號、川農(nóng)16號、川麥10號、綿陽26號、川麥20號5種小麥粒在萌發(fā)的過程中GABA含量的變化結(jié)果可知：不同小麥品種中GABA含量不同；發(fā)芽麥粒中GABA含量的動(dòng)態(tài)變化趨勢呈先增高后降低。這是由于小麥在發(fā)芽過程中，谷氨酸在內(nèi)源性蛋白酶和谷氨酸脫羧酶的共同作用下產(chǎn)生了GABA，同時(shí)生成的GABA在轉(zhuǎn)氨酶的催化下形成琥珀酸半醛而被不斷被消耗，導(dǎo)致GABA含量下降。根據(jù)這一規(guī)律可以對小麥等糧食作物進(jìn)行GABA的富集，并對富集工藝進(jìn)行優(yōu)化，做到對GABA的最大化富集，我國小麥品種多、類型豐富，因此，篩選出高GABA含量的小麥品種也是亟需要解決的課題。

4 結(jié)論

本研究建立了一種檢測麥粒中GABA含量的HPLC方法，采用 FDNB進(jìn)行柱前衍生，Luna C18（2）（150 mm×4.60 mm，5μm）色譜柱，乙腈 －0.02 mmol／L乙酸銨（15∶85）混合溶液為流動(dòng)相，作為最優(yōu)色譜條件，結(jié)果表明在0.025 5～0.127 6μg范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系，最低檢出限1.081×10－5μg／mL，平均加標(biāo)回收率為97%。采用此方法測定小麥品種在萌發(fā)12 h后的GABA含量在0.238～5.26 mg／100 g之間，品種間GABA的含量差異顯著，0～12 h期間，GABA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在8 h時(shí)含量達(dá)到最高。

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Determination ofγ－Aminobutyric Acid（GABA）in Germinated Wheat Seed by HPLC

Zhang Zhiqing Xu Jie Cong Jun Ren Fei
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya′an 625014）

The HPLC determination method forγ－aminobutyric acid（GABA）in germinated wheat seed has been improved in the paper.Meanwhile，the GABA content in 10 different kinds ofwheat cultivars from Sichuan area have been investigated by HPLC method.Isocratic elution was used for separation and quantification of GABA derivateswith FDNB.GABA was determined on Luna C18（2）（150 mm×4.6 mm，5μm）with mobile phase of acetate ammonium（0.02 mmol／L）and acetonitrile（V∶V＝85∶15）.The flow rate was 1.0 mL／min；column temperature 30℃，and the detection wave length was 320 nm respectively.The results indicated that a good linearity was observed within a range from 0.025 5～0.127 6μg.The limitof detection is1.081×10－5μg／mL.The average recoveries are 97%for GABA determination.GABA content ranged 0.238～5.26mg／100 g in differentwheat varieties after germination 12 h was determined by the established method.The significant difference of content in GABA among different varietieswas also observed.During germination of 0～12 h，GABA content has shown a trend of first increased and then decreased，with content peak at8 h.

germinated wheat seed，γ－aminobutyric acid（GABA），HPLC

TS210

A

1003－0174（2015）11－0135－05

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（09ZA081）

2014－04－22

張志清，男，1976年出生，教授，糧油副產(chǎn)物開發(fā)利用