皮狀絲孢酵母脂肪酸CoA連接酶 （Facl）基因的克隆與分析

尚?；?王忠銘 袁振宏 朱順妮 秦 磊 呂鵬梅

（中國科學院可再生能源重點實驗室 中國科學院廣州能源研究所，廣州 510640）

皮狀絲孢酵母脂肪酸CoA連接酶 （Facl）基因的克隆與分析

尚?；?王忠銘 袁振宏 朱順妮 秦 磊 呂鵬梅

（中國科學院可再生能源重點實驗室 中國科學院廣州能源研究所，廣州 510640）

從皮狀絲孢酵母（Trichosporon cutaneum）中克隆了Facl基因及其5′-上游序列，并對Facl基因及其5′-上游序列進行了分析。根據(jù)前期的基因組文庫測序結果，獲得了898 bp DNA序列。以此為基礎，2次使用染色體步移（Genomewalking）方法，分別獲得了854 bp和1 236 bp 5＇-DNA序列。根據(jù)獲得的5＇和3＇端序列，合成引物用于擴增Facl基因的全長DNA和cDNA序列。分析發(fā)現(xiàn)，皮狀絲孢酵母Facl基因cDNA包含一個1 662 bp的開放讀碼框，DNA不含內含子序列。同時獲得了482 bp的5′-上游序列。在5′-上游序列區(qū)域存在一系列預測的順式作用元件。相似性分析的結果表明T．cutaneum和Rhodococcus erythropolis的Fac l氨基酸序列相似性最高。該研究旨在為后繼的Facl基因的功能和表達的研究、油脂代謝的遺傳改造奠定基礎。

皮狀絲孢酵母 Facl基因 5′-上游序列 序列分析

隨著化石能源即將耗竭以及生態(tài)環(huán)境日益惡化，可再生能源受到全世界的青睞。作為可再生能源的一員，生物柴油因其具備可生物降解、清潔、無毒和可再生等優(yōu)點，引起人們的廣泛關注［1］，同時，與傳統(tǒng)的石化柴油相比較，生物柴油具有相似的化學特性［2］。目前，生物柴油主要是利用植物油制備，然而大規(guī)模發(fā)展植物來源的生物柴油將需要占用大量土地以及導致食用油短缺。在這種情況下，微生物油脂成為生物柴油的可持續(xù)原料。

產油微生物因具備可產生大量油脂、生長迅速及所產生油脂的脂肪酸組成與植物油相似等特點，被認為是一種可選擇的生物柴油原料［3-4］。已經發(fā)現(xiàn)許多微生物可以積累油脂，包括細菌、酵母、微藻和絲狀真菌。

皮狀絲孢酵母（Trichosporon cutaneum）是一種可以同時利用葡萄糖和木糖的產油酵母［5］。T．cutaneum不僅可以利用葡萄糖和木糖，還可以利用各種生物質的水解液，包括玉米芯的酸水解液［6-7］和大米草的水解液［8］等，因此，T．cutaneum用于制備生物柴油具備廣泛的應用前景。但是，關于T．cutaneum油脂合成途徑調控的研究還非常少，限制了利用基因工程技術對T．cutaneum產油性能進行改造。

脂肪酸CoA連接酶（Facl）可以催化脂肪酸、ATP和CoA合成脂酰CoA。它通過將游離脂肪酸活化為它們的CoA硫酯，在不同的代謝和調控過程中發(fā)揮著重要作用，包括油脂生物合成、脂肪酸降解、中間代謝、基因表達、三酰甘油摻入、信號轉導和基因表達調控［9-10］。Facl催化的反應通過兩步進行。首先，脂肪酸和ATP反應生成脂酰-AMP和焦磷酸。其次，脂酰-AMP和 CoA反應，生成脂酰 CoA和AMP。根據(jù)碳鏈的長度，脂肪酸可以被劃分為3種類型：短鏈（C1-C4），中鏈（C5-C16）和長鏈（大于C16）。與Facl在細胞代謝中的多種功能相對應，許多微生物含有可利用不同長度碳鏈脂肪酸的Facl同工酶［11-12］。

鑒于Facl在油脂代謝調控中的重要功能，本研究從T．cutaneum中克隆了Facl基因并對其進行了分析。該工作為以后Facl基因的功能分析、超量表達研究、抑制表達研究及對T．cutaneum油脂代謝的遺傳調控奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

皮狀絲孢酵母2.571購買自中國普通微生物菌種保藏管理中心。大腸桿菌（E．coli）DH5α由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

Taq酶、pMD20-T載體、T4DNA Ligase、Genome walking kit、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、RNA提取試劑RNAiso Plus reagent、反轉錄酶 PrimeScript Reverse Transcriptase：大連寶生物公司；PCR儀 Mycycler：Bio-Rad公司；離心機 Centrifuge 5417R：Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)Tanon-1600：上海天能科技有限公司；電泳系統(tǒng)DYY-7C：北京市六一儀器廠。

1.1.3 引物序列

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物根據(jù)Genome walking kit試劑盒的使用說明設計。引物序列見表1。

表1 皮狀絲孢酵母Facl基因擴增使用的引物

1.1.4 生物信息學分析

同源基因通過NCBI Blast搜索被發(fā)現(xiàn)（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／）。潛在的 motif通過 ScanProsite Results Viewer工具被發(fā)現(xiàn)（http：／／cn.expasy.org／prosite／）。等電點 p I和分子質量通過Compute p I／Mw工具被計算出（http：／／www.expasy.ch／tools／pi tool.html）。序列比對使用 Clustal W 軟件。進化樹的構建利用MEGA 4軟件。功能域的搜索利用NCBI網站的NCBICD Search在線工具。

1.2 方法

1.2.1 總DNA和總RNA的提取

12 000 r／min離心2 min收集對數(shù)生長期的酵母細胞，然后按照CTAB法提取基因組DNA［13］。處于對數(shù)生長期的酵母細胞經離心后，去除上清，向細胞沉淀中加入RNAiso Plus reagent，按照試劑盒的說明書提取總RNA。取1μg RNA使用oligo（dT）17引物和反轉錄酶PrimeScript Reverse Transcriptase進行反轉錄反應生成cDNA。

1.2.2 Facl基因的 5′Genome walking

本實驗室在前期的T．cutaneum基因組文庫測序中獲得了一個898 bp的Facl DNA片段。根據(jù)已獲得的T．cutaneum Facl基因的部分DNA序列，設計用于5′Genome walking試驗的引物 Facl（5sp1）和Facl（5sp2），按試劑盒的說明書進行 PCR，以獲取基因的5′-端DNA序列。由于第1次5′Genome walking沒有發(fā)現(xiàn)起始密碼子。因此根據(jù)第1次5′Genome walking的結果，設計出用于第2次5′Genome walking的引物Facl-25sp1和Facl-25sp2。PCR產物回收純化、連接、轉化與重組子檢測均按常規(guī)的分子生物學試驗方法進行［14-15］。陽性重組子送上海英駿生物技術公司測序。

1.2.3 Facl基因全長及5′-上游序列的獲得和分析

將得到的T．cutaneum Facl基因的部分DNA序列與2次5′Genomewalking擴增獲得的DNA序列進行拼接。根據(jù)拼接序列，設計出擴增Facl基因DNA和cDNA全長的引物（Facl-N和Facl-C）以及擴增5′-上游序列的引物 Facl（qs）和 Facl（qa），來驗證拼接序列的正確性。使用NCBIBlastx軟件進行Facl基因的同源性比對。使用PlantCARE軟件對5′-上游序列中潛在的順式作用元件進行分析。

2 結果與討論

2.1 Facl部分DNA序列的獲得

前期的T．cutaneum基因組文庫測序獲得了898 bp DNA。利用Blast x軟件分析獲得的序列。結果顯示：T．cutaneum的898 bp DNA序列翻譯為氨基酸序列后與Rhodococcus erythropolis的Facl氨基酸序列相似性最高，為99%。與Rhodococcus opacus、Rhodococcus imtechensis和 Rhodococcus sp.DK17的 Facl氨基酸序列相似性分別為87%、87%和86%。上述結果表明所獲得的部分序列是Facl基因的序列。

2.2 Facl基因的5′Genome walking結果與分析

根據(jù)已獲得的Facl基因的部分序列，用5′Genome walking的方法擴增得到了Facl的5′端 DNA。第1次使用 Facl（5sp1）和 Facl（5sp2）進行的 5′Genome walking獲得了854 bp序列，該序列與898 bp核心序列重疊，表明獲得了正確的DNA 5′端序列。但是，經過Blastx比對，發(fā)現(xiàn)得到的DNA 5′端序列不夠完整，尚未擴增到起始密碼子區(qū)域。因此，根據(jù)獲得的854 bp序列設計引物Facl-25sp1和Facl-25sp2進行了第2次5′Genome walking，獲得了1236 bp DNA序列，該序列與第1次5′Genome walking的結果重疊，表明獲得了正確的第2次5′Genomewalk-ing結果。分析獲得的DNA 5′端序列時，發(fā)現(xiàn)了位于起始密碼子上游長度為482 bp的5′-上游序列。

2.3 Facl基因全長序列和5′-上游序列的獲得

利用設計的Facl基因的DNA全長擴增引物以及5′-上游序列的擴增引物進行驗證，表明5′-上游序列及拼接的序列均正確。T．cutaneum Facl開放讀碼框（ORF）為1662 bp（圖1和圖2）。使用 BioEdit軟件對全長DNA和cDNA序列進行比較，發(fā)現(xiàn)T．cutaneum Facl基因不含內含子。

圖1 Facl基因的全長cDNA序列

圖2 皮狀絲孢酵母Facl基因的全長cDNA和DNA

將T．cutaneum Facl氨基酸序列進行Blast p同源性比對后，發(fā)現(xiàn)與已知Facl氨基酸序列具有廣泛的同源性。利用Clustal W和MEGA 4軟件，構建了Facl的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 3）。T．cutaneum Facl與Rhodococcus erythropolis Facl表現(xiàn)出最高的相似性，這符合傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)。

圖3 采用Neighbor-Joining方式根據(jù)Facl氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹

2.4 Facl全序列的分析

使用NCBICD-Search進行分析，發(fā)現(xiàn)T．cutaneum Facl存在保守的功能域 FACL_like_2、LCFACS_euk和CaiC，這些功能域與合成脂酰CoA相關。在預測的T．cutaneum Facl蛋白序列中發(fā)現(xiàn)了保守的ATP結合motif。ScanProsite Results Viewer分析結果表明從197位到208位的序列ILFTSGTSGrPK是預測的ATP結合motif，這是Facl家族的典型特征。T．cutaneum Facl蛋白預測的等電點p I為4.96，分子質量為59.988 ku。

2.5 Facl 5′-上游序列的分析

使用引物 Facl（qs）和 Facl（qa），以 T．cutaneum基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲得了482 bp 5′-上游序列。該序列包含典型的啟動子元件CAAT box（圖4）。此外，還發(fā)現(xiàn)了與光照、激素和環(huán)境脅迫響應相關的調控元件，包括CGTCA-motif（參與茉莉酸甲酯響應）、TCA-element（參與水楊酸響應）、MBS（參與干旱脅迫應答）和光照響應元件（C-box、CATT-motif、G-box、GTGGC-motif）。這些潛在的順式作用元件為今后進一步研究環(huán)境條件對Facl表達的影響提供了線索。

圖4 在皮狀絲孢酵母Facl基因的5′-上游序列區(qū)域預測的順式作用元件

3 結論

對從T．cutaneum中克隆到的基因序列和其編碼的氨基酸序列進行了分析，并以GenBank中部分細菌及真菌的脂肪酸CoA連接酶氨基酸序列為基礎進行了系統(tǒng)進化分析。結果表明擴增所得的序列為編碼脂肪酸CoA連接酶的基因，其大小為1 662 bp。

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Cloning and Characterization of a Gene Encoding Fatty Acid CoA Ligase（Facl）from Trichosporon Cutaneum

Shang Changhua Wang Zhongming Yuan Zhenhong Zhu Shunni Qin Lei LüPengmei
（CASKey Laboratory of Renewable Energy，Guangzhou Institute of Energy Conversion，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510640）

The Facl gene and its 5＇-flanking sequence has cloned from Trichosporon cutaneum and amalysis.Based on the former result of genome library sequencing，898 bp DNA sequence was obtained.Based on the 898 bp DNA sequence，the 5＇genomic DNA was cloned by genome walkingmethod；854 bp and 1 236 bp DNA sequences were amplified respectively in two genomewalking experiments.On the basis of the5＇and 3＇terminisequences，primerswere synthesized to amplify the full-length genomic DNA and cDNA sequence.The full-length Facl cDNA contained 1 662 bp open-reading frame（ORF），while the full-length DNA did’t contain intron sequence.In addition，482 bp 5＇-flanking sequence was obtained.Therewere a number of predicted cis-acting elements in 5＇-flanking sequence.The results of similarity analysis revealed that the highest identity of Facl amino acid sequence could be found between T．cutaneum and Rhodococcuserythropolis.The study has laid foundation for further research on the function and overexpression of Facl gene，genetic manipulation of lipid metabolism as a success.

Trichosporon cutaneum，F(xiàn)acl gene，5＇-flanking sequence，sequences analysis

Q789

A

1003-0174（2015）01-0071-05

國家科技支撐計劃（2011BAD14B03），國家自然科學基金（31100189）

2013-09-27

尚?；?，男，1980年出生，助理研究員，微生物學

袁振宏，男，1953年出生，研究員，生物質能技術