固定化磷脂酶A1催化制備DHA型磷脂

馬彥慶 陳斌斌 鄭 妍 修志龍 楊天奎 牟 英

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院1，大連 116000）（豐益（上海）生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司2，上海 200000）

固定化磷脂酶A1催化制備DHA型磷脂

馬彥慶1陳斌斌2鄭 妍2修志龍1楊天奎2牟 英1

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院1，大連 116000）（豐益（上海）生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司2，上海 200000）

以磷脂酰膽堿（PC）富集物和二十二碳六烯酸（DHA）濃縮液為底物，正己烷為反應(yīng)介質(zhì)，在固定化磷脂酶A1（PLA1）的催化作用下，制備DHA型磷脂（PL－DHA）。研究了底物摩爾比、加酶量、溶劑用量、反應(yīng)溫度、水活度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)PL－DHA制備的影響。通過(guò)條件優(yōu)化，確定最佳條件為：DHA濃縮液和PC的摩爾比為4∶1，加酶量為2種底物總質(zhì)量的20%，溶劑用量為4 mL，反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間為2 h。經(jīng)氣相色譜定量分析，得到的磷脂中DHA的含量為17.7mg／g PL，并用棒狀薄層色譜火焰離子檢測(cè)器（TLC－FID）分析了PC含量隨反應(yīng)的變化。

磷脂酰膽堿 二十二碳六烯酸 固定化磷脂酶A1

磷脂（PL）是生物膜重要組成部分，而且在細(xì)胞各種活性上起著重要作用，作為常用乳化劑和抗氧化劑，磷脂在食品、化妝品及醫(yī)藥行業(yè)也有廣泛應(yīng)用［1］。近年來(lái)，DHA因其具有促進(jìn)嬰幼兒智力發(fā)育，提高認(rèn)知力及免疫力［2］等特性成為研究熱點(diǎn)。研究表明，DHA生理功能因其載體分子形式不同而有所差異，因此人們開(kāi)始重視DHA與磷脂的雙重作用。大量試驗(yàn)表明磷脂型DHA比甘三酯型DHA更有利于DHA吸收［3］，可以更快速地為大腦皮層提供所需DHA［4］等。

由于從海產(chǎn)品中分離、富集DHA型磷脂比較復(fù)雜，且有產(chǎn)地及原料限制，其產(chǎn)量無(wú)法滿(mǎn)足人們需求，需要利用其他方法進(jìn)行制備［5］。DHA型磷脂的制備方法有化學(xué)法與酶法，化學(xué)法因催化劑非專(zhuān)一性和試劑毒性，會(huì)造成副產(chǎn)物多且影響產(chǎn)品安全性。酶法則具備較多優(yōu)勢(shì)：首先，酶具有位置特異性，既可以選擇磷脂特定位點(diǎn)進(jìn)行催化反應(yīng)，也可以選擇性地催化特定底物，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品安全性好；其次，酶法反應(yīng)條件溫和，具有環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)［6］。近些年來(lái)不斷有研究者嘗試采用酶法制備DHA型磷脂［7－8］。本研究報(bào)道固定化PLA1催化酸解反應(yīng)制備DHA型磷脂。

1 材料和方法

1.1 材料與方法

1.1.1 原料與試劑

濃縮磷脂：秦皇島金海食品工業(yè)有限公司，主要組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：磷脂酰乙醇胺（PE）11.96%、磷脂酰肌醇（PI）8.86%、磷脂酰膽堿（PC）11.34%、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）2.71%；藻油：廈門(mén)匯盛生物有限公司，其中DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥35%；磷脂酶A1酶液：諾維信公司。

1.1.2 儀器

Agilent7820A氣相色譜儀：美國(guó)Agilent Technologies有限公司；IATROSCAN MK－6S TLC－FID：日本三菱雅特?。↖ATRON）公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PC的富集

參考張秀青等［9］的方法，對(duì)濃縮磷脂中的PC進(jìn)行富集，得到PC提取物經(jīng)高效液相色譜定量檢測(cè)，其中PC 59.4%、PE 19.91%、溶血磷脂酰膽堿（LPC）1.62%。經(jīng)由氣相色譜檢測(cè)PC脂肪酸組成，計(jì)算其平均分子質(zhì)量約為773 u。

1.2.2 DHA的富集

參考Domart等［10］的方法，富集DHA經(jīng)氣相色譜檢測(cè)純度為95.49%。平均分子質(zhì)量約為320 u。

1.2.3 固定化PLA1的制備

按照2∶1∶1（g∶mL∶mL）比例分別添加牌號(hào)為D380的堿性離子交換樹(shù)脂、磷脂酶A1酶液及20 mmol／L（pH 5.5）磷酸鹽緩沖液，在30℃搖床中以100 r／min的轉(zhuǎn)速振蕩6 h，然后于30℃真空干燥箱內(nèi)干燥至水分為2.5%。

1.2.4 酸解反應(yīng)

取200mg PC，按比例加入DHA濃縮液，然后按照設(shè)定加入正己烷，底物溶解后，加入定量固定化PLA1，充氮保護(hù)，反應(yīng)完成后分離固定化酶，終止反應(yīng)。

反應(yīng)過(guò)程中搖床的轉(zhuǎn)速均為250 r／min。

1.2.5 產(chǎn)物的分離

反應(yīng)完成后回收反應(yīng)液，并以正己烷洗滌固定化酶3次，將洗滌液與反應(yīng)液合并，低溫旋蒸除去溶劑得粗產(chǎn)品。然后用冷丙酮將粗產(chǎn)品脫油3次，離心后收集沉淀層，然后低溫真空干燥。

1.2.6 磷脂中DHA含量的分析

1.2.6.1 磷脂的甲酯化

稱(chēng)取一定質(zhì)量樣品，溶于正己烷，以C13∶0甲酯為內(nèi)標(biāo)物，參考Seung等［11］方法進(jìn)行甲酯化后，備氣相色譜定量分析。以下數(shù)據(jù)中DHA含量均為磷脂產(chǎn)物中含有DHA的質(zhì)量含量。

1.2.6.2 氣相色譜的條件

檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器。色譜柱型號(hào)為：CP－Sil 88 50 m×0.25 mm（0.2μm）。毛細(xì)管柱柱壓：14.84 psi。進(jìn)樣量：1μL。分流比：20∶1。進(jìn)樣口溫度：250℃。柱溫箱升溫程序?yàn)椋?0℃保持2 min，以10℃／min的速率升高至120℃，然后以5℃／min的速率升高至180℃后保持2 min，再以2℃／min的速率升高至206℃，之后以25℃／min的速率升高至230℃后保持5 min，最后運(yùn)行2 min。

1.2.7 磷脂中PC含量檢測(cè)

1.2.7.1 TLC－FID掃描條件

稱(chēng)取一定質(zhì)量的樣品，加入甲醇∶乙醇（體積比）＝1∶1溶液溶解。色譜柱型號(hào)為：CHROMAROD－SIII。掃描速度：30 s／根。展開(kāi)劑配比（體積比）為：氯仿∶甲醇∶水＝72∶31∶3.2。檢測(cè)器為FID檢測(cè)器，氫氣流速為160 mL／min，空氣流量為2 L／min。

1.2.7.2 PC濃度與TLC－FID中PC出峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

取PC標(biāo)樣，溶解于氯仿中，然后進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e配制成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：

Y＝0.000 2－1.022 9，其中R2＝0.990 4。

式中：Y為PC濃度／mg／mL；為峰面積。

1.2.7.3 PC含量的計(jì)算

由1.2.7.1所述條件對(duì)樣品進(jìn)行掃描，然后根據(jù)1.2.7.2公式得到溶液的濃度，最后根據(jù)如下公式計(jì)算得到樣品中PC含量：

PC＝VY／M×100%

式中：V為溶液體積／mL；Y為樣品濃度／mg／mL；M為稱(chēng)樣質(zhì)量／mg。

2 結(jié)果與討論

在預(yù)試驗(yàn)中，分別選取正己烷、甲苯、叔丁醇作為反應(yīng)溶劑，以商品NOVOZYM 435酶、TL IM酶、固定化PLA1作為催化劑，發(fā)現(xiàn)固定化PLA1在正己烷體系中的反應(yīng)較優(yōu)，磷脂產(chǎn)物中DHA含量較高，所以采用固定化PLA1作為催化劑，正己烷為溶劑進(jìn)行反應(yīng)優(yōu)化。

2.1 底物比對(duì)反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度為40℃、加酶量為底物總質(zhì)量15%、溶劑用量為5 mL、反應(yīng)時(shí)間為2 h條件下，考察DHA∶PC／mol∶mol對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 底物比對(duì)反應(yīng)的影響

由圖1可知，隨著底物比由2∶1升高至4∶1，DHA含量有所增加，但是隨著底物比繼續(xù)增加，DHA含量開(kāi)始減少，同時(shí)PC水解也逐漸嚴(yán)重，原因可能是DHA濃縮液中含有一定水分，隨著DHA添加量增加，累積的水分造成PC水解。在此條件優(yōu)化中，DHA含量在底物比4∶1處達(dá)到最大值，所以選擇底物比為4∶1繼續(xù)優(yōu)化反應(yīng)溫度。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)的影響

在底物比為4∶1、加酶量為底物總質(zhì)量15%、溶劑用量為5 mL、反應(yīng)時(shí)間為2 h條件下，考察反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)的影響

由圖2可知，隨著溫度由35℃升高至40℃，DHA含量有所增加，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，DHA含量開(kāi)始減少，這是因?yàn)?，一定范圍?nèi)提高反應(yīng)溫度雖然可提高底物傳導(dǎo)速率，增強(qiáng)酶活力，加快反應(yīng)速度，但是高溫會(huì)使酶發(fā)生熱變性［13］。在溫度低于40℃時(shí)，酶活力增強(qiáng)，底物傳導(dǎo)速率加快，有利于反應(yīng)進(jìn)行。然而超過(guò)這一溫度時(shí)，溫度過(guò)高引起酶的熱變性。另一方面，隨著溫度升高，PC水解逐漸變得嚴(yán)重，可知在考察溫度范圍內(nèi)，溫度升高不利于產(chǎn)物回收。DHA含量在溫度為40℃時(shí)處于最大值，所以選擇此溫度繼續(xù)優(yōu)化加酶量。

2.3 加酶量對(duì)反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度為40℃、底物比為4∶1、溶劑用量為5 mL、反應(yīng)時(shí)間為2 h條件下，考察加酶量對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 加酶量對(duì)反應(yīng)的影響

由圖3可知，當(dāng)加酶量由10%增加至25%時(shí)，DHA含量逐漸增加，但是當(dāng)加酶量繼續(xù)增加時(shí)，DHA含量卻開(kāi)始減少。原因可能是當(dāng)加酶量較少時(shí)，反應(yīng)開(kāi)始底物未被酶飽和，隨著加酶量增加，底物逐漸被酶飽和，反應(yīng)速度隨之加快，但加酶量過(guò)多，會(huì)對(duì)底物傳導(dǎo)產(chǎn)生阻礙作用，使反應(yīng)速度降低。當(dāng)加酶量為20%與25%時(shí)，DHA含量最高，考慮20%的加酶量更適合實(shí)際生產(chǎn)需要，所以選擇此加酶量繼續(xù)優(yōu)化溶劑用量。

2.4 溶劑用量對(duì)反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度為40℃、底物比為4∶1、加酶量為底物總質(zhì)量20%、反應(yīng)時(shí)間2 h條件下，考察溶劑用量對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)正己烷用量由7 mL減少至6 mL時(shí)，DHA含量有所增加，溶劑用量繼續(xù)減少，DHA含量基本不再變化。這是因?yàn)楦鶕?jù)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的米氏方程，當(dāng)?shù)孜餄舛容^小時(shí)，底物濃度越大，反應(yīng)速度越快，而當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時(shí)，反應(yīng)速度則不會(huì)出現(xiàn)明顯變化。在溶劑用量為4 mL時(shí)，DHA含量相對(duì)較高，而且與6 mL相比，需要溶劑量較少，更適合實(shí)際生產(chǎn)需要，所以選此溶劑用量繼續(xù)優(yōu)化水活度。

圖4 溶劑用量對(duì)反應(yīng)的影響

2.5 水活度對(duì)反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度為40℃、底物比為4∶1、溶劑用量為4 mL、加酶量為底物總質(zhì)量20%、反應(yīng)時(shí)間2 h條件下，考察水活度對(duì)反應(yīng)的影響。水活度的控制按照Ducret等［14］描述的方法。

圖5 水活度對(duì)反應(yīng)的影響

由圖5可知，當(dāng)水活度為0.11時(shí)，DHA含量較小，這是因?yàn)槊富盍π枰欢ǖ乃疃葋?lái)保持［15］，而此水活度過(guò)低，酶活力較差。隨著水活度增加至0.33，酶活力增加，DHA含量隨之有所升高，但當(dāng)水活度繼續(xù)增大，DHA含量開(kāi)始減少，而且PC的水解也變得更為嚴(yán)重。當(dāng)體系水分較高時(shí)，作為副反應(yīng)的水解反應(yīng)將成為主要反應(yīng)。所選用4個(gè)水活度的反應(yīng)結(jié)果與未平衡水活度的反應(yīng)結(jié)果作比較發(fā)現(xiàn)，未平衡水活度的反應(yīng)較優(yōu)，推測(cè)此時(shí)水活度應(yīng)該在0.11與0.33之間，選擇此水活度繼續(xù)優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間。

2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度為40℃、底物比為4∶1、溶劑用量為4 mL、加酶量為底物總質(zhì)量20%條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

由圖6可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間由1.0 h增加至2.0 h時(shí)，DHA含量有所增加，反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)增加，DHA含量基本不變。這是因?yàn)樵诜磻?yīng)進(jìn)行至2.0 h時(shí)，已達(dá)到平衡點(diǎn)，隨著反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)增加，反應(yīng)體系中各種物質(zhì)的質(zhì)量不會(huì)發(fā)生變化。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了利用固定化PLA1催化富含PC的磷脂進(jìn)行酸解反應(yīng)從而得到DHA型磷脂的方法。由試驗(yàn)的優(yōu)化，當(dāng)磷脂用量為200mg時(shí)，得到的最優(yōu)酸解反應(yīng)條件為：DHA濃縮液和PC的摩爾比為4∶1，加酶量為2種底物總質(zhì)量的20%，溶劑用量為4 mL，反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間為2.0 h。

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Preparation of Phospholipid－Docosahexaenoic Acid Catalyzed by Immobilized Phospholipase A1

Ma Yanqing1Chen Binbin2Zheng Yan2Xiu Zhilong1Yang Tiankui2Mu Ying1
（School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology1，Dalian 116000）
（Functional Food Technology Department，Wilmar（Shanghai）Biotechnology Research and Development Center Company Limited2，Shanghai 200000）

A facile enzymatic synthesis approaching to prepare phospholipid－docosahexaenoic acid（PLDHA）has been investigated through the phospholipase A1（PLA1）－catalyzed reaction of docosahexaenoic acid（DHA）aswell as phospholipid enriched in phosphatidylcholine（PC）.The alteration elements of different parameters such asmolar ratio of substrates，reaction temperature，enzyme dosage，solvent dosage，water activity and reaction time have been researched systematically.The ratio of DHA and PCwas4∶1（mol／mol），the enzyme dosagewas the 20%of two substrates，the solvent dosagewas4mL and the reaction temperature and reaction time were 40℃and 2 h. By the quantitative analysis of GC，the content of DHA was detected to be 17.7mg／g PL on the optimal condition. The variation of PC content before and after the reaction was also analyzed by The Thin Layer Chromatography－Flame Ion Detector（TLC－FID）.

phosphatidylcholine，docosahexaenoic acid，immobilized phospholipase A1

TS229

A

1003－0174（2015）03－0075－05

2013－11－28

馬彥慶，男，1988年出生，碩士，生物化工

修志龍，男，1965年出生，教授，生物化工