響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取板栗蛋白的工藝研究

呂 佼 趙 媛 金世超 王建中 王豐俊

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取板栗蛋白的工藝研究

呂 佼 趙 媛 金世超 王建中 王豐俊

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

在堿溶酸沉的基礎(chǔ)上采用超聲波輔助提取板栗蛋白，分別研究了pH、超聲時間、提取溫度、提取時間對板栗蛋白提取率的影響。首先，用單因素試驗確定影響因素及水平，然后，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過四因素三水平的響應(yīng)面試驗來確定最佳的提取工藝。結(jié)果表明，較優(yōu)的提取工藝是：提取溫度為40℃，提取時間為83 min，提取pH為10，超聲時間為14 min，在此條件下實際測得的平均提取率為65.38%，基本符合理論預(yù)測值（66.64%）。

板栗蛋白 響應(yīng)面 提取率 工藝優(yōu)化 堿溶酸沉

板栗屬殼斗科（Fagaceae）栗屬（Castanea Mill），落葉喬木［1］，在中國已有2 000多年的栽培歷史。其營養(yǎng)成分豐富，果實中含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、磷、鐵以及多種維生素，其中蛋白質(zhì)占5%～11%，高于稻米，并且富含賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸等水稻和大豆類的第一、二限制性氨基酸［2］。由此可見，板栗蛋白可以補充禾谷類和豆類中限制氨基酸的不足，使膳食的營養(yǎng)成分更加完善，具有極大的開發(fā)潛力。

國內(nèi)外對蛋白質(zhì)的分離提取已有多年的研究歷史，尤其對大豆蛋白、核桃蛋白等都有深入的研究，但對板栗蛋白質(zhì)的研究鮮有報導(dǎo)。板栗蛋白的提取方法主要有2種，一種是傳統(tǒng)的堿水法，這種方法的缺點是提取時間長，提取率低。另一種是張海暉等［3］亞臨界水萃取法，這種方法的缺點是提取蛋白的溫度達到180℃，溫度過高容易造成蛋白的變性。超聲波輔助堿溶酸沉法提取板栗蛋白彌補了這2種方法的不足，由于超聲波具有乳化、均質(zhì)和熱效應(yīng)，在進行提取時，能有效地打破邊界層，大大提高提取速率，縮短提取時間，并且能有效降低提取溫度，保護蛋白的活性［4－5］。本試驗以遷西燕豐板栗為原料，選取提取溫度、提取pH、提取時間、超聲破碎時間為試驗條件，對板栗蛋白提取率的影響進行了響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，以期為板栗蛋白的進一步研究提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

遷西板栗：遷西板栗去殼切片，冷凍干燥后磨粉，過60目篩備用（微量凱氏定氮儀測得其粗蛋白質(zhì)量分數(shù)為10.13%）。

1.2 試劑

NaOH、濃HCl、95%乙醇、考馬斯亮藍G250、90%正磷酸，所用試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

JAV－IV型超聲波細胞粉碎儀：濟寧市奧波超聲波電器有限公司；Thermo Fisher LL1 500凍干機：美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 板栗蛋白提取工藝

采用堿溶酸沉法，準確稱取板栗粉，按1∶15料液比加入蒸餾水，用1 mol／L NaOH調(diào)節(jié)pH到指定pH，超聲波破碎后，在設(shè)定的水浴溫度下提取一定時間。浸提液4 000 r／min離心15 min，取上清液，用1 mol／L HCl調(diào)節(jié)pH至等電點，在5 000 r／min下離心15 min，取沉淀，用蒸餾水洗1次，調(diào)pH值至中性，冷凍干燥。

1.4.2 標準曲線的制作

取50.00 g牛血清蛋白定容到50.00 mL容量瓶配置成1mg／mL蛋白母液，分別取1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL于10 mL容量瓶中定容搖勻。取不同濃度的蛋白溶液1 mL于試管中，加5 mL考馬斯亮藍溶液，顯色2 min，用紫外分光光度計在595 nm處測定其吸光度。

1.4.3 可溶性蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍法測定提取液中蛋白質(zhì)的吸光度，通過標準曲線計算出提取液中蛋白質(zhì)濃度，計算公式如下：

式中：Y為蛋白提取率／%；C為上清液中可溶性蛋白濃度／mg／mL；V為蛋白提取液體積／mL；M為板栗中蛋白含量／g。

1.4.4 板栗蛋白等電點的測定

取300mL板栗蛋白提取液，采用Bradford法［6］，用紫外分光光度計在595 nm處測定其吸光度通過標準曲線計算出蛋白質(zhì)提取液的濃度C1，分別取60 mL蛋白提取液于燒杯中，用1 mol／mL的HCl分別調(diào)pH到3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，靜置30 min，在5 000 r／min下離心15 min，分別取上清液1 mL加5 mL考馬斯亮藍溶液，顯色2 min，于595 nm波長下測紫外吸光度，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度C2，計算殘留率X［7］，公式如下：

1.4.5 可溶性蛋白提取的單因素試驗

分別以不同的超聲破碎時間、提取pH、提取溫度及提取時間為單因素，考察各因素對可溶性蛋白提取率的影響。

1.4.6 板栗蛋白提取工藝的響應(yīng)面試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，運用Design Expert8.0軟件程序，根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，以板栗蛋白的提取率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析對提取條件進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的測定

將不同濃度的牛血清蛋白，用Bradford法，在595 nm處測定其吸光度，繪圖制得的標準曲線見圖1。

2.2 板栗蛋白等電點的測定

用考馬斯亮藍法分別測定離心后上清液中蛋白質(zhì)含量，計算殘留率，殘留率最低時的pH即為蛋白的等電點。由圖2回歸方程求得，板栗蛋白殘留率在pH 4.2時最低。因此，板栗蛋白的等電點為pH 4.2。

圖1 蛋白標準曲線

圖2 板栗蛋白等電點測定

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 提取pH對板栗蛋白提取率的影響

在保持其他條件不變（液料比為15 mL／g、超聲處理時間為6 min、提取溫度為40℃、時間為60 min），改變提取pH，板栗蛋白提取率隨pH的變化如圖3所示。pH為9.50時板栗蛋白的提取率最高，pH＞9.50后提取率反而降低，這是因為溶液pH會直接影響兩性分子蛋白質(zhì)的表面帶電情況，從而影響蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與溶劑間的相互作用，使蛋白質(zhì)的溶解性發(fā)生改變。強堿條件可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)中賴氨酸與丙氨酸或胱氨酸發(fā)生縮合反應(yīng)，蛋白質(zhì)難以溶出，并且影響蛋白質(zhì)品質(zhì)，導(dǎo)致提取率的下降［8］。因此浸提的pH控制在9.50左右為佳。

圖3 提取pH對提取率的影響

2.3.2 超聲時間對板栗蛋白提取率的影響

在一定的條件下，超聲破碎時間越長越有利于蛋白質(zhì)的溶解，但是破碎達到一定程度，淀粉的過度溶出反而會影響蛋白的提取［9－10］。從圖4可以看出，保持其他條件不變（液料比為15 mL／g、提取pH為9、提取溫度為40℃、時間為60 min），超聲破碎時間為10 min時板栗蛋白的提取率最高。因此，超聲破碎時間為10 min左右為佳。

圖4 超聲破碎時間對提取率的影響

2.3.3 提取溫度對板栗蛋白提取率的影響

提取溫度對板栗蛋白提取率的影響見圖5，從圖5可以看出，保持其他條件不變（液料比為15 mL／g、超聲處理時間為6 min、提取pH為9、提取時間為60 min），隨著提取溫度的提高，蛋白的溶解度提高，當提取溫度超過40℃，隨著溫度的升高提取率降低，這可能是由于板栗淀粉發(fā)生糊化作用，與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)難以溶出，反而會降低蛋白質(zhì)的提取率［10］。因此，板栗蛋白最佳提取溫度應(yīng)控制在40℃左右。

圖5 提取溫度對提取率的影響

2.3.4 提取時間對板栗蛋白提取率的影響

在保持其他條件不變（液料比為15 mL／g、超聲處理時間為6min、提取pH為9、提取溫度為40℃），改變提取時間，板栗蛋白提取率隨提取時間的變化如圖6所示。一定條件下，浸提時間越長，板栗蛋白質(zhì)的溶出率越高，但是超過80 min溶出率則不再提高而是呈減少趨勢，可能由于蛋白質(zhì)分子溶脹飽和導(dǎo)致可溶性蛋白溶出率降低。因此，板栗蛋白的最佳提取時間應(yīng)控制在80 min左右。

圖6 提取時間對提取率的影響

2.4 響應(yīng)面分析法對板栗蛋白提取工藝的優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面模型的建立及結(jié)果

響應(yīng)面分析的試驗結(jié)果見表1。

采用Design Expert 8.0軟件程序?qū)υ囼灁?shù)據(jù)進行回歸分析，得出板栗蛋白提取率的四元二次回歸方程如下：Y＝60．58＋1．67A＋3．41B＋4．23C＋3．17D＋0．30AB－2．06AC＋1．28AD－4．42BC＋3．37BD＋9．76CD－17．85A2－5．67B2－3．23C2－8．45D2。

對回歸方程做顯著性檢驗與方差分析，見表2。

表2 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

注：**－（P＜0.01）為極顯著；*－（P＜0.05）為顯著。

從方差分析結(jié)果可知，回歸模型在P＜0.01時水平差異顯著，其決定系數(shù)R2＝0.944 8，說明模型能夠反映響應(yīng)值的變化，回歸方程適用于提取板栗蛋白的理論預(yù)測值。失擬項差異不顯著，說明殘差均由隨機誤差引起［11］。回歸方程的二次項A2、B2、C2、D2達到極顯著水平，一次項B、C、D以及交互項CD、BC均達到高度顯著水平，說明響應(yīng)值的變化相當復(fù)雜，試驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。由F檢驗可知影響板栗蛋白質(zhì)提取率因素的主次關(guān)系為：C＞B＞D＞A，即超聲時間＞提取時間＞提取pH＞提取溫度。

2.4.2 響應(yīng)面分析

由顯著性檢驗得：試驗中CD（即超聲時間和提取pH的交互作用）對板栗蛋白提取率的影響極顯著，BC（即超聲時間和提取時間的交互作用）對板栗蛋白提取率的影響顯著，它們之間的交互作用響應(yīng)面圖見圖7和圖8，其他因素間交互作用影響不顯著（未列出）。

圖7 Y＝f（C，D）的響應(yīng)面

圖8 Y＝f（B，C）的響應(yīng)面

2.4.3 提取工藝條件的確定

為進一步確定最佳點，利用Design Expert8.0軟件程序?qū)に嚄l件進行優(yōu)化，可得板栗蛋白提取率的最佳方案為：提取溫度40.09℃，提取時間82.99 min，提取pH 9.90，超聲時間14min，在此工藝條件下，軟件程序?qū)Π謇醯鞍滋崛÷实念A(yù)測值為66.64%。為了實際的操作方便，將板栗蛋白的提取工藝參數(shù)修正為：提取溫度40℃，提取時間83 min，提取pH 10，超聲時間14 min。在此條件下實際測得的平均提取率為65.38%，與理論預(yù)測值相比相對誤差在1.88%左右。因此采用修正后的方法得到的提取參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面法對板栗蛋白的提取工藝進行了優(yōu)化，得到超聲波輔助堿溶酸沉法提取板栗蛋白的最佳工藝條件：提取pH為10，超聲時間為14 min，提取溫度為40℃，提取時間為83 min。在最佳工藝條件下，板栗蛋白提取率可達66.64%。在板栗蛋白等電點pH 4.20進行酸沉，可實現(xiàn)板栗蛋白最大沉淀量。響應(yīng)面優(yōu)化后的超聲波輔助堿提酸沉法提高了板栗蛋白的提取得率，節(jié)約了物料和溶劑，為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)。

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Optimization on Ultrasonic－Assisted Extraction of Protein from Chestnut by Response Surface Analysis

LüJiao Zhao Yuan Jin Shichao Wang Jianzhong Wang Fengjun
（College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

Ultrasonic was used to assist alkali－solution and acid－isolation extraction of chestnut protein.The effects of pH，ultrasonic time，extraction temperature and extraction time on the extraction rate of chestnut protein were researched.First，the affecting factor and the level by single factor experimentwere selected，then the optimum extraction process condition was determined based on the regression analysis on the basis of single factor experiment using a 4－factor，3－level response surfacemethodology.The results showed that the optimum extraction conditions of chestnut protein were：extraction temperature 40℃，extraction time 83 min，pH 10，ultrasonic time 14 min.Under the optimum extraction conditions，the actualmeasured average extraction rate was 65.38%which was basically conformed to the theoretical predicted value（66.64%）.

chestnut protein，response surface，extraction rate，technology optimization，alkali－solution and acid－isolation

TS201.2

A

1003－0174（2015）03－0041－05

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201204401）

2013－11－26

呂佼，女，1989年出生，碩士，油脂與植物蛋白開發(fā)

王豐俊，男，1975年出生，碩士生導(dǎo)師，油脂與植物蛋白開發(fā)