富硒玉米肽對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用

張 巖 何 慧 張久亮 王 馳 侯 燾

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院環(huán)境食品學教育部重點實驗室，武漢 430070）

富硒玉米肽對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用

張 巖 何 慧 張久亮 王 馳 侯 燾

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院環(huán)境食品學教育部重點實驗室，武漢 430070）

研究富硒玉米肽對四氯化碳（Carbon tetrachloride，CCl4）誘導的小鼠肝損傷的保護作用。將健康的雄性昆明小鼠70只，隨機分成7組：正常對照組、CCl4模型組、富硒玉米肽低、中、高劑量組（100、200、400mg／kg·bw）、普通玉米肽組（200mg／kg·bw）、水飛薊素陽性對照組（50mg／kg·bw），每組10只。測定比較血清中谷丙轉氨酶（ALT）活力、谷胱甘肽（GSH）、三酰甘油（TG）含量，同時測定肝組織中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）的含量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）活力，肝臟指數(shù)，并觀察肝組織病理學變化。結果顯示富硒玉米肽低、中、高劑量組均能極顯著抑制CCl4致肝損傷小鼠血清ALT活性和TG含量的升高、GSH含量的降低（P＜0.01）；均能極顯著提高肝組織中GSH含量和SOD、GSH－Px活力，并降低肝組織中MDA的含量（P＜0.01），極顯著降低由于肝損傷引起的肝臟腫大（P＜0.01），改善肝組織損傷程度，并存在劑量效應關系。富硒玉米肽高劑量組的護肝效果與50mg／kg·bw的水飛薊素相當，相同劑量的富硒玉米肽的保肝作用極顯著優(yōu)于普通玉米肽（P＜0.01）。結果表明富硒玉米肽對CCl4所致小鼠急性肝損傷有顯著的保護作用，且與普通玉米肽相比，富硒玉米肽的有效保肝劑量顯著降低。

富硒玉米肽 CCl4肝損傷模型 保肝

硒是人和動物體必需的微量元素，是人體內多種硒蛋白的必需成分，具有抗氧化［1，2］、抗癌［3］、提高機體免疫力［4］、預防心腦血管疾?。?］、保肝［6］等諸多生理功能。其中最突出的作用是抗氧化，硒可以作為谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）的活性中心，清除體內過多的活性氧自由基和過氧化物，此外機體內大量存在的非酶硒化合物也能直接捕獲脂質自由基（R·）及過氧化脂質自由基（ROO·），從而起到抗氧化作用［7］。硒的抗氧化作用及其與肝病的關系已有一些報道，預防性補硒可以降低肝炎的人群發(fā)病率，阻斷慢性肝病向肝癌轉化［8］。與無機硒相比，生物轉化的有機硒因其安全性、補硒效率高而備受青睞。

近年來，國內外學者已從酶解玉米蛋白制備玉米活性肽，并發(fā)現(xiàn)其具有降血壓［9］、抗疲勞、抗氧化［10］、促進酒精代謝［11］、防治肝性腦病［12］等生理功能。本實驗室曾對醒酒保肝玉米肽的制備、活性、機理及結構進行了較系統(tǒng)地研究，結果顯示玉米肽對酒精性肝損傷［13］、半乳糖胺致肝損傷［14］、卡介苗與脂多糖誘導的小鼠免疫性肝損傷［15］都具有良好的保護作用。鑒于硒具有較強的抗氧化能力，而玉米肽又具有較好的保肝活性，本研究以富硒玉米肽為研究對象，以期利用硒和玉米肽的雙重功效協(xié)同保肝。CCl4誘導的肝損傷模型是一種常用的化學性肝損傷的動物模型，用來研究保肝藥物和其他物質對肝細胞損傷的保護作用。水飛薊素是指從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取得到的一種黃酮木脂素類化合物，長期被用于臨床治療肝臟疾病，因此，在試驗中常作為陽性對照藥物。本實驗室的前期研究顯示與普通玉米肽相比，富硒玉米肽的醒酒效果更為顯著［16］，因此本試驗采用小鼠CCl4急性肝損傷模型，通過測定血清中谷丙轉氨酶（ALT）活力、谷胱甘肽（GSH）和三酰甘油（TG）含量，同時測定肝組織中丙二醛（MDA）和GSH含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）的活力、肝臟指數(shù)，并觀察肝組織病理學變化，評價富硒玉米肽對小鼠的保肝作用，為進一步開發(fā)利用富硒植物蛋白資源，提高其附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料

富硒玉米：湖北省恩施土家族苗族自治州雙河鄉(xiāng)；普通玉米：市售；富硒玉米肽、普通玉米肽均由本實驗室自制［16］。制得的富硒玉米肽和普通玉米肽的粗蛋白質量分數(shù)分別為63.15%、63.30%，硒含量分別為6.19、0.02μg／g。

1.1.2 主要試劑

谷丙轉氨酶（ALT）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）、考馬斯亮蘭試劑盒：南京建成生物工程研究所；三酰甘油（TG）試劑盒：上海名典生物工程有限公司；水飛薊素（Silymarin）：德國馬博士大藥廠；堿性蛋白酶（Alcalase 3.0T）：丹麥諾維信公司；硒標準溶液（1 000μg／mL）：天津市光復精細化工研究所；CCl4：上海國藥集團；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

UV－102－02WF紫外可見分光光度計：日本Shimadzu公司；Prepscale 1.6 L超過濾系統(tǒng)：美國MILLIPORE公司；HPIAS高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)：華海醫(yī)療信息技術股份有限公司；LGJ－12冷凍干燥機：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；全波長酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；AFS－8220型原子熒光光度計：北京吉天儀器有限公司。

1.1.4 試驗動物

昆明種小鼠：體重（18～22）g，雄性，購于湖北省疾病預防控制中心試驗動物中心。許可證號：SCXK（鄂）2008－0005。

1.2 試驗方法

1.2.1 富硒玉米肽、普通玉米肽的制備［16］

取適量富硒玉米蛋白粉，配成質量濃度為2.86 g／100mL的水溶液，沸水浴處理30 min，調溫度至60℃、調pH值至8.00，按所用玉米蛋白粉質量的0.6%加入Alcalase堿性蛋白酶，邊攪拌邊不斷加入0.1 mol／L的NaOH溶液，維持pH 8.00直至pH值不再變化，取出燒杯冷卻至室溫，選用截留分子質量為5 ku的再生纖維素卷式超濾膜進行超濾分離，將膜透過物濃縮凍干后備用。普通玉米肽的制備方法同上。

1.2.2 小鼠CCl4急性肝損傷模型的建立［17］

將70只昆明種雄性小鼠隨機分成7組，每組10只，分別為正常對照組、CCl4模型組、富硒玉米肽低、中、高劑量組、普通玉米肽組、陽性對照水飛薊素組。各組均以小鼠標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。參考本實驗室普通玉米肽的研究結果［17］以及預試驗確定的肽灌胃劑量，室溫25℃下適應1周后，正常對照組和CCl4模型組按每日定時10 mL／kg·bw灌胃生理鹽水1次，富硒玉米肽低、中、高劑量組每日分別按100、200和400mg／kg·bw（硒含量分別為0.62、1.24、2.48 μg／kg·bw）劑量灌胃富硒玉米肽1次，普通玉米肽組每日按200mg／kg·bw劑量灌胃普通玉米肽1次，陽性對照組按每日50mg／kg·bw劑量灌胃水飛薊素1次。連續(xù)灌胃15 d，于末次給藥4 h后，各組按10 mL／kg·bw的量腹腔注射0.125%CCl4的溶液（溶于橄欖油中），正常對照組則腹腔注射等體積的生理鹽水。禁食16 h（不禁水）后，眼球取血處死小鼠，剖腹取出肝臟，生理鹽水漂洗后，取肝一葉制肝勻漿，另一葉用10%福爾馬林溶液固定供組織病理學切片用。在整個飼養(yǎng)周期內，每2 d稱1次體重，所有小鼠體重均呈增長趨勢，組間無顯著性差異。本研究中實驗動物的使用嚴格遵守GB 14925—2001。

1.2.3 生化指標檢測

按試劑盒說明書方法分別測定血清中ALT活力、GSH、TG含量，肝組織勻漿中GSH、MDA含量、SOD、GSH－Px活力。

1.2.4 肝臟指數(shù)的測定

各組小鼠稱重后處死，取肝臟，用預冷的生理鹽水清洗，濾紙吸去血液，稱濕重。計算肝臟指數(shù)［18］。

肝臟指數(shù)／mg／g＝肝臟質量（mg）／體重（g）

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包中的單因素方差分析和Duncan氏多重比較，P＜0.01表示差異極顯著。試驗結果以平均值±標準差（X±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 富硒玉米肽對CCl4致肝損傷小鼠血清中ALT、GSH、TG的影響

由表1可以看出，與正常對照組比較，模型組小鼠的血清中ALT活性、TG含量極顯著增高，GSH含量極顯著的降低（P＜0.01），從以上生化指標來看，CCl4誘導的肝損傷造模成功。灌胃富硒玉米肽后，ALT活力、TG含量極顯著降低、GSH含量極顯著升高（P＜0.01），并且富硒玉米肽低、中、高各劑量組間呈現(xiàn)出明顯的劑量－效應關系。高劑量組的各項指標與陽性對照組水飛薊素（50mg／kg·bw）的效果相當。高劑量組GSH含量、ALT活性、TG含量與陽性對照組組間無顯著性差異。與等劑量的普通玉米肽組相比，中劑量富硒玉米肽組的ALT活性、TG含量極顯著降低，GSH含量極顯著升高（P＜0.01）。

表1 富硒玉米肽對CCl4肝損傷小鼠血清中ALT、GSH、TG的影響

表2 富硒玉米肽對CCl4肝損傷小鼠肝勻漿中GSH、MDA、SOD、GSH－Px的影響

2.2 富硒玉米肽對CCl4肝損傷小鼠肝勻漿中GSH、MDA、SOD、GSH－Px的影響

由表2可以看出，與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織中的MDA含量、SOD活性、GSH含量、GSH－Px活性有極顯著差異。與模型組相比，富硒玉米肽各劑量組的SOD、GSH含量、GSH－Px活性均極顯著升高，MDA含量極顯著降低（P＜0.01），并且呈現(xiàn)一定的劑量－效應關系。與陽性對照組水飛薊素組相比，灌胃高劑量組的富硒玉米肽后，小鼠肝組織中的GSH含量有極顯著的升高（P＜0.01）。與普通玉米肽組相比，等劑量的富硒玉米肽組GSH含量、SOD活性極顯著升高（P＜0.01）。

2.3 富硒玉米肽對CCl4肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

由表3可以看出，與正常對照組相比，模型組的肝臟指數(shù)極顯著增大（P＜0.01）。與模型組相比，富硒玉米肽中、高劑量組肝臟指數(shù)極顯著降低。與普通玉米肽相比，等劑量的富硒玉米肽的肝臟指數(shù)與之有極顯著的差異（P＜0.01），400mg／kg·bw富硒玉米肽組的肝臟指數(shù)與陽性對照組50mg／kg·bw水飛薊素相當。

表3 富硒玉米肽對CCl4致肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

總體來說，200mg／kg·bw的普通玉米肽與100mg／kg·bw的富硒玉米肽的保肝效果相當，提示硒的協(xié)同增效作用可以使玉米肽的有效保肝劑量大大降低。

2.4 小鼠肝組織病理學檢查

圖1 富硒玉米肽對CCl4誘導肝損傷小鼠肝組織形態(tài)學變化的影響

小鼠肝組織病理學切片如圖1所示。鏡檢觀察到正常對照組肝小葉結構清晰，肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列、肝竇結構規(guī)整，中央靜脈周圍未見炎性細胞浸潤（見圖1a）；CCl4模型組肝細胞排列紊亂，圍繞中央靜脈周圍許多塊狀壞死灶，炎性細胞浸潤明顯，大部分細胞核出現(xiàn)空泡，有明顯自溶現(xiàn)象，可見彌漫性壞死細胞，核明顯大小不等，呈不同程度的固縮（見圖1b）；富硒低劑量組（見圖1c）與模型組比較，略有改觀，但仍有大量炎癥細胞浸潤；富硒中劑量組（見圖1d）中央靜脈周圍肝細胞壞死減少，有少量炎癥細胞浸潤；富硒高劑量組（見圖1e）炎性細胞浸潤少，肝細胞排列整齊，接近正常對照組和水飛薊素組（見圖1g）；而普通玉米肽組（見圖1f）中央靜脈周圍仍有肝細胞壞死，部分細胞核出現(xiàn)空泡，可見大量炎癥細胞浸潤。

3 討論

本試驗結果表明富硒玉米肽能夠顯著抑制由CCl4誘導的小鼠血清中ALT活性、TG含量的升高和GSH含量的降低，同時亦可顯著抑制肝組織勻漿中SOD活性、GSH－Px活性的降低和MDA含量的升高，且呈劑量－效應關系。其機制可能是由于富硒玉米肽能夠直接清除自由基，例如羥基自由基［16］，從而抑制脂質過氧化反應。前期研究表明富硒玉米肽中富含Cys等含硫氨基酸［19］，巰基具有較強的自由基淬滅能力［20］，而通常硒能夠取代硫的位置，生成硒代氨酸，亦具有一定的抗氧化能力；富硒玉米肽能增加SOD、GSH－Px等抗氧化酶的活性，從而加快自由基的清除，最終抑制MDA的生成，從而促進肝細胞的修復和再生。此外富硒玉米肽富含Leu、Ile等支鏈氨基酸，具有較高的F值，高F值寡肽具有治療或緩解肝性腦病的癥狀，改善手術后及臥床病人的蛋白質營養(yǎng)狀況等生理功能［21］，有報道高F值的蛋白質水解物，被用于臨床治療肝硬化［22］。本試驗中，富硒玉米肽顯著改善由于CCl4損傷造成的肝臟腫大，進一步證實了富硒玉米肽的良好作用。組織病理學切片也表明富硒玉米肽具有良好的保肝效果。

在蛋白含量相當?shù)那闆r下，200mg／kg·bw的普通玉米肽與100mg／kg·bw的富硒玉米肽的保肝效果大致相當，說明微量元素硒在其中發(fā)揮了重要作用。相關研究顯示富硒大麥苗、煙葉硒蛋白等也由于含有微量元素硒，與普通大麥苗、煙葉蛋白相比，表現(xiàn)出更好的保肝效果［8，23］，但其機制尚需進一步的研究。相同劑量的富硒玉米肽的保肝效果顯著優(yōu)于普通玉米肽，這可能與玉米蛋白水解物中的硒肽和含硒氨基酸的貢獻有關，有報道含硒氨基酸能夠直接或間接地發(fā)揮抗氧化作用［24］。此外硒也能清除CCl4在體內轉化過程中形成的中間代謝產(chǎn)物及降低其毒害作用。如果組織中缺硒會造成細胞膜的損傷，因此硒的抗氧化作用可能抑制了肝細胞損傷［25－26］，從而起到了與玉米肽協(xié)同保肝作用。

4 結論

本研究表明富硒玉米肽對CCl4所致小鼠急性肝損傷有顯著的保護作用，且與普通玉米肽相比，富硒玉米肽的有效保肝劑量顯著降低。

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Hepatoprotective Effects of the Selenium－Enriched Corn Peptides Against Carbon Tetrachloride－Induced Liver Injury in Mice

Zhang Yan He Hui Zhang Jiuliang Wang Chi Hou Tao
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Key Laboratory of Environment Correlative Dietology Ministry of Education，Wuhan 430070）

The hepatoprotective effects of the selenium－enriched corn peptides have been evaluated to treat carbon tetrachloride（CCl4）－induced liver injury inmice.Seventy healthy Kunmingmalemicewere randomized into 7 groups for 10 mice／group as normal control group，CCl4－injured model group，low dose group，medium dose group and high dose group（100，200 and 400mg／kg·bw respectively），selenium－enriched corn peptides treatment group，corn peptides（200mg／kg·bw）treatment group and positive control group－silymarin（50mg／kg·bw）treatment group.The activity of alanine aminotransferase（ALT），the glutathione（GSH）level，the triglyceride（TG）level in serum，the activity of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSHPx），malondialdehyde（MDA）level and glutathione（GSH）level in liverwere determined aswell as the hepatic tissue index.Themorphology of hepatic tissue was also examined.The results showed that selenium－enriched corn peptides could significantly decrease ALT’PerillaLs activity，TG content level in serum，MDA level in liver（P＜0.01）and the liver enlargement.The selenium－enriched corn peptides could significantly increase GSH level，SOD activity，GSH－Px activity in liver（P＜0.01）in a dose－dependentmanner.The biochemical resultswere supple-mented by histopathological examination of liver section.The hepatoprotective effect of selenium－enriched corn peptides was significantly better than the normal corn peptideswith the same dose（P＜0.01）.When selenium－enriched corn peptides concentration reached to 400mg／kg·bw，its effectwas approximate to silymarin（50mg／kg·bw）.In conclusion，the study demonstrates that selenium－enriched corn peptides had a significant protective effect against CCl4－induced liver damage.The dose of selenium－enriched corn peptides with the potent hepatoprotective effect was significantly less than that of the normal corn peptides.

selenium－enriched corn peptides，CCl4－induced liver injurymodel，hepatoprotection

Q514

A

1003－0174（2015）

國家自然科學基金（30972043），863計劃（2008AA10 Z314），中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項（2013PY095）

2013－12－02

張巖，女，1989年出生，碩士，食品化學

通迅作者：何慧，女，1960年出生，教授，博士生導師，食品化學03－0006－06