水產(chǎn)動物諾卡氏菌病防控技術(shù)的研究進(jìn)展

陳言峰，范祖游，王子濤，洪煜宇，付立霞，張輝華*(.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東佛山583;.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州5009)

諾卡氏菌(Nocardia)是隸屬放線菌目(Actinomycetales)、諾卡氏菌科(Nocardiaceae)［1］的一類革蘭氏陽性絲狀桿菌，廣泛分布于土壤和水體中，是人類和動物重要的條件致病菌。近年來，諾卡氏菌病(Nocardiosis)對全球的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。目前，能引起水產(chǎn)動物諾卡氏菌病的病原有鰤魚諾卡氏菌(Nocardia seriolae)［3-6］、星狀諾卡氏菌(N.asteroids)［7-8］、粗形諾卡氏菌(N.crassostreae)［9］與殺鮭諾卡氏菌(N.salmonicida)［10］。

水產(chǎn)動物致病性諾卡氏菌生長較為緩慢，且感染初期癥狀不明顯，但該病具有持續(xù)時(shí)間長、發(fā)病率、死亡率高等特點(diǎn)，在感染初期難以對該病進(jìn)行診斷和防治。因此，建立快速的診斷技術(shù)，及時(shí)采取有效的防治措施，對于控制諾卡氏菌病的蔓延和傳播是極其重要的。

1 診斷與檢測技術(shù)

目前，針對水產(chǎn)動物諾卡氏菌病病原快速檢測方法的研究主要集中在鰤魚諾卡氏菌。Kono等［11］與蔣依依等［12］分別利用16S-23S rRNA轉(zhuǎn)錄間隔序列PCR技術(shù)對鰤魚諾卡氏菌進(jìn)行了快速檢測。Wang等［13］通過設(shè)計(jì)特異性引物建立了鰤魚諾卡氏菌的PCR檢測方法，該方法特異性較高，僅能檢測出鰤魚諾卡氏菌，而星狀諾卡氏菌、殺鮭諾卡氏菌和皮疽諾卡氏菌則未擴(kuò)增出任何條帶。Shi等［14］利用DNA芯片技術(shù)建立了鰤魚諾卡氏菌的檢測技術(shù)，且該技術(shù)靈敏度極高。王國良等［15］利用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)建立了魚類致病性鰤魚諾卡氏菌的檢測方法，隨后又通過鰤魚諾卡氏菌16S-23S rRNA基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物建立了檢測該菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，用于快速檢測大黃魚、養(yǎng)殖水體和飼料中的鰤魚諾卡氏菌［16］。滿其蒙［17］根據(jù)鰤魚諾卡氏菌rpoA基因序列設(shè)計(jì)了4條引物，也成功建立了該菌的LAMP檢測方法。

孫渭歌等［18］根據(jù)諾卡氏菌rpoB、secA1、16S rRNA 基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了星狀諾卡氏菌的多重PCR檢測方法。Carrasco等［19］與夏洪麗等［20］分別通過16S-23S rRNA 轉(zhuǎn)錄間隔序列PCR技術(shù)建立了粗形諾卡氏菌與殺鮭諾卡氏菌的快速檢測方法。

2 藥物防治

Ismail等［21］在研究110株鰤魚諾卡氏菌對抗生素的敏感性時(shí)發(fā)現(xiàn)所有α-葡萄糖苷酶陽性的菌株對紅霉素敏感，但對鹽酸土霉素耐藥;所有α-葡萄糖苷酶陰性的菌株對鹽酸土霉素敏感，絕大部分菌株對紅霉素耐藥。Itano等［22］發(fā)現(xiàn)從患病魚類分離到的多株鰤魚諾卡氏菌對噁喹酸與卡那霉素較為敏感。蔣依依等［23］研究發(fā)現(xiàn)從患病加州鱸分離的鰤魚諾卡氏菌菌株對卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素和氯霉素等敏感。徐曉麗等［24］報(bào)道絲足鱸源鰤魚諾卡氏菌菌株對紅霉素、氟苯尼考、鏈霉素、強(qiáng)力霉素和阿奇霉素等敏感，此2種來源的菌株的共同之處是均對磺胺類和青霉素類耐藥。陳昌福等［25］采用二倍稀釋法研究了部分抗生素對浙江、江蘇等地區(qū)烏鱧源鰤魚諾卡氏菌菌株的抑菌效果，并用篩選出的氨芐青霉素、交沙霉素和硫氰酸紅霉素進(jìn)行野外治療，取得了較好的效果。分離自廣東地區(qū)患病烏鱧的鰤魚諾卡氏菌菌株對紅霉素、四環(huán)素和氨芐西林較為敏感［26］。滿其蒙［17］研究了3種抗生素對卵形鯧鲹鰤魚諾卡氏菌病的防治效果，發(fā)現(xiàn)攻毒后第1天投恩諾沙星、第4天投紅霉素時(shí)治療效果較好，而氟苯尼考則適用于早期預(yù)防。從患病卵形鯧鲹分離到的另1株鰤魚諾卡氏菌則對鹽酸恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星敏感［27］。

Isik等［28］利用紙片擴(kuò)散法研究了致病性諾卡氏菌對磺胺類衍生物的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鰤魚諾卡氏菌對磺胺異惡唑、甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲基異惡唑復(fù)合物等敏感，星狀諾卡氏菌對阿米卡星和磺胺異惡唑等敏感，而殺鮭諾卡氏菌對阿米卡星等敏感。Chen等［29］報(bào)道魚類星狀諾卡氏菌可用甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲基異惡唑復(fù)合物、利福平和強(qiáng)力霉素等藥物治療。林偉等［30］研究了患病招財(cái)魚源星狀諾卡氏菌的藥物敏感性，發(fā)現(xiàn)該菌株對紅霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明等抗生素敏感。

研究表明，全池潑灑菌毒消(復(fù)合碘溶液)、沐菌消(20%戊二醛溶液)或苯扎氯銨進(jìn)行消毒對魚類諾卡氏菌病也有較好的預(yù)防效果［31-32］。此外，市面上出售的“諾卡氏套餐”也具有良好的防治效果［33］。

3 免疫防治

Tomokazu 等［34］分別對五條鰤注射 N.soli、N.fluminea、N.uniformis和弱毒N.seriolae活菌后，依次用 N.seriolae強(qiáng)毒株進(jìn)行感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射N.soli、N.fluminea的五條鰤對強(qiáng)毒株的感染只有微弱的保護(hù)力，而注射弱毒N.seriolae后存活下來的魚對強(qiáng)毒株感染具有較高的保護(hù)力。Kato等［35］利用牛型結(jié)核桿菌卡介苗免疫牙鲆后，通過感染鰤魚諾卡氏菌發(fā)現(xiàn)牙鲆IFN-γ基因表達(dá)水平輕微上升，而C型和G型溶菌酶基因表達(dá)水平顯著升高，表明該疫苗接種后提高了血清溶菌酶的活性，也暗示接種該疫苗后的牙鲆對抗鰤魚諾卡氏菌感染要通過非特異性免疫反應(yīng)如溶菌酶的釋放來實(shí)現(xiàn)。Shimahara等［36］分別用4株鰤魚諾卡氏菌(其中2株為α-葡萄糖苷酶陽性，2株為α-葡萄糖苷酶陰性)與弗氏不完全佐劑的混合物對大口黑鱸進(jìn)行免疫，發(fā)現(xiàn)2次加強(qiáng)免疫以后外周血液中的溶菌酶活性和NBT陽性細(xì)胞數(shù)量并未明顯升高，而且多次免疫后并未降低活菌感染時(shí)的死亡率。Nayak等［37］研究證實(shí)鰤魚諾卡氏菌的活菌苗、滅活疫苗以及重組干擾素γ均能夠?qū)a魚產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，該研究結(jié)果有助于疫苗設(shè)計(jì)或輔助治療鰤魚諾卡氏菌病。彭程遠(yuǎn)等［38］研究了鰤魚諾卡氏菌全肽聚糖(WPG)對烏鱧部分非特異性免疫指標(biāo)的影響，結(jié)果表明鰤魚諾卡氏菌WPG能夠調(diào)節(jié)烏鱧血細(xì)胞吞噬指數(shù)、血清替代途徑補(bǔ)體活力及組織中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活力，但調(diào)節(jié)作用的強(qiáng)弱具有組織差異性，且WPG免疫烏鱧21 d后才會對鰤魚諾卡氏菌感染產(chǎn)生明顯的抵御作用。解俊等［39］用滅活的鰤魚諾卡氏菌疫苗免疫烏鱧后，通過測定血細(xì)胞數(shù)量、血清總蛋白含量、血清堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活力，證實(shí)鰤魚諾卡氏菌的滅活菌苗能引發(fā)烏醴血細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)血清中的部分非特異性免疫指標(biāo)發(fā)生變化，以提高魚體自身的免疫力。

4 其他預(yù)防措施

4.1 加強(qiáng)管理 選擇健康的苗種，放養(yǎng)前將體表有損傷和已有病癥的魚種挑出并隔離［40］。定時(shí)巡塘，觀察魚群的活力及攝食情況。在疾病流行季節(jié)應(yīng)對養(yǎng)殖水體嚴(yán)格消毒。一旦環(huán)境突變，應(yīng)預(yù)防水質(zhì)、底質(zhì)的惡化［41］。

4.2 養(yǎng)殖密度適宜，加強(qiáng)良種選育 實(shí)施良種養(yǎng)殖，加大良種選育工作的力度，增強(qiáng)魚種對致病性諾卡氏菌的抵抗力。采用合理的養(yǎng)殖密度，減少應(yīng)激，降低諾卡氏菌病的發(fā)病機(jī)率［32］。

4.3 使用新鮮飼料，且避免經(jīng)常投喂冰鮮野雜魚 由于許多冰鮮野雜魚攜帶大量的致病性諾卡氏菌［42］，因此應(yīng)改變投喂冰鮮魚的習(xí)慣，選用新鮮優(yōu)質(zhì)的配合飼料，以減少傳染源，避免諾卡氏菌病的暴發(fā)。

4.4 提高魚體免疫力 疾病流行季節(jié)到來之前，可在飼料中添加適量免疫增強(qiáng)劑。通過增強(qiáng)水產(chǎn)動物的非特異性免疫力，達(dá)到預(yù)防疾病的效果。

5 存在問題

盡管水產(chǎn)動物致病性諾卡氏菌的檢測技術(shù)已日益成熟，但在藥物防治方面目前仍缺乏對抗諾卡氏菌的特效藥物。另外，來自不同地區(qū)、不同來源、不同宿主的不同菌株對某些抗生素的敏感性往往具有較大的差異。更為嚴(yán)重的是，養(yǎng)殖戶長期使用某些藥物已引發(fā)病原菌的耐藥性，為諾卡氏菌病的治療帶來了較大困難。雖然有學(xué)者對水產(chǎn)動物諾卡氏菌病進(jìn)行了疫苗方面的研究，但無論是滅活疫苗還是弱毒疫苗效果都很有限。目前，尚未見到關(guān)于水產(chǎn)動物諾卡氏菌病的中草藥防治方面的報(bào)道，關(guān)于其拮抗菌的篩選方面的研究也很少。陳輝［43］報(bào)道諾卡氏菌與海豚鏈球菌為拮抗菌，該研究結(jié)果可為諾卡氏菌病生態(tài)防治的研究提供參考。此外，諾卡氏菌的致病機(jī)制仍然不清楚。因此，今后有必要在諾卡氏菌的致病機(jī)理和防治方面進(jìn)行更深入研究。

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