葉綠素熒光分析技術在林木研究中的應用

李正華，李海霞，李 靜，白 卉(黑龍江省林業(yè)科學研究所速生林木培育重點實驗室，黑龍江哈爾濱150081)

光合作用是所有生命進行物質代謝和能量代謝的基礎，它涉及光物理、光化學和生物化學轉變等過程。光合作用中植物吸收光能將其傳遞、轉換為電能，這一過程被稱作原初反應階段，在這一階段有一部分光能損耗以較長的熒光方式發(fā)射出去［1］。發(fā)射熒光是植物被暴露在過強的光照或逆境下，自我保護的一種方式，可避免葉綠體吸收超過自身光合能力需要的能量，將強光灼傷或逆境傷害降低到最小。此外，研究表明植物葉片葉綠素熒光發(fā)射量和光合速率是負相關，也就是說光合速率高，發(fā)射的熒光減弱;當光合速率下降時，發(fā)射的熒光會增強。

自發(fā)現(xiàn)葉綠素熒光現(xiàn)象以來，人們開始利用葉綠素熒光的變化來研究植物的光合作用。現(xiàn)有研究表明，植物葉片初始熒光(Fo)、可變熒光(Fv)、最大熒光(Fm)、最大光能轉換效率(Fv/Fm)及潛在活性(Fv/Fo)等葉綠素熒光參數(shù)，在一定程度上均能夠反映植物的光合能力或生長環(huán)境的變化。

1 葉綠素熒光分析技術的應用

1．1 逆境脅迫 鑒于葉綠素熒光參數(shù)能夠反映植物的光合能力或生長環(huán)境的變化，以及葉綠素熒光分析技術所具備的快速、靈敏、無損傷優(yōu)勢，因此該技術可以作為測定植物生理變化的工具，無論何種逆境對光合作用一系列過程的影響都將由葉綠素熒光誘導動力學反映出來［2－3］。

1．1．1 光脅迫。植物光合作用過程中，當光能大于光合系統(tǒng)所必需的量時，光合速率將降低，發(fā)生光抑制現(xiàn)象。表現(xiàn)為當光的能量進一步增大時，可誘導產生有害物質，損傷光合器官，引起Fo的增加。在以往的研究中，學者認為光抑制是PSⅡ傷害的同義詞，然而現(xiàn)已證明這一現(xiàn)象不僅是PSⅡ傷害的一種表現(xiàn)形式，而且還是一種光保護過程［4－5］。馮志立等［6］在測定植物葉綠素熒光參數(shù)日變化時發(fā)現(xiàn)隨著光照強度的不斷增加，F(xiàn)m、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo都下降，表明光抑制逐漸加劇;之后隨著光強減弱這些葉綠素熒光參數(shù)升高，光抑制得到緩解。在澳洲堅果［7］、棉花［8］、玉米［9］和水稻［10］等植物的研究中，研究人員均得到類似“V”字型的葉綠素參數(shù)日變化趨勢，這表明植物在中午強光和較高溫度下產生光脅迫現(xiàn)象，光合活性受到短暫抑制，但光合器官并沒有受到損傷，隨著光強和溫度的下降這些植物的光合器官功能又完全恢復。

1．1．2 鹽脅迫。植物由鹽脅迫帶來的危害在內部生理機制上表現(xiàn)為降低葉綠素和類胡蘿卜素的含量(單位鮮重計)、葉綠體對光能的吸收能力和熒光猝滅速率等。馬翠蘭等［11］研究了鹽脅迫下柚的生理反應及適應性變化，試驗結果表明隨鹽濃度的增加和脅迫時間的延長，柚葉片F(xiàn)v/Fo，F(xiàn)v/Fm及△Fv/Fm比值均下降。梁海永等［12］對歐洲黑楊的研究中，認為鹽脅迫對黑楊的影響是降低了葉片PSII光化學效率(Fv/Fm)和光化學猝滅系數(shù)(qP)，增加了非光化學猝滅系數(shù)(qN)。彭建云［13］對抽穗期小麥進行鹽處理時，發(fā)現(xiàn)15～20 d后DK961的Fo及Fv/Fm均沒有顯著變化，而LM15的Fo極顯著增加和Fv/Fm顯著下降，說明此時LM15的PSⅡ受到破壞或者發(fā)生可逆失活。而鹽脅迫對DK961的Fo和Fv/Fm并沒有產生顯著影響，這可能暗示了該植株對鹽脅迫具有較大的抗性，但不論怎樣，F(xiàn)v/Fm的變化程度至少可以反映鹽脅迫下植物的光合系統(tǒng)運轉狀況及其對鹽的抗性。

1．1．3 溫度脅迫。植物生長需要在一定的溫度范圍內，當環(huán)境溫度超出植物適應的范圍時，將對植物產生脅迫。按照溫度的高低，可以將溫度脅迫劃分為低溫脅迫和高溫脅迫(也稱熱脅迫)。

1．1．3．1 低溫脅迫。低溫會直接導致光合機構的損傷，同時也會影響諸多酶系統(tǒng)發(fā)揮作用。在低溫脅迫下，由于植物對光抑制的敏感性增強，即使中、低光強也會使植物發(fā)生光抑制。相關研究表明:低溫誘導下，植物Fo上升，光合電子傳遞速率(ETR)、Fv/Fo和Fv/Fm的比值明顯降低，葉綠素二氯酚靛酚(DCPIP)光還原活性同時降低［14］。在對我國華山松5個種源的研究表明:華山松抗低溫能力的變化與其種源地理變異趨勢是一致的，同時，得出結論為保證華山松在不利環(huán)境中對光能的吸收與利用，維持高水平的非光化學猝滅能力，可以有效避免強光對光系統(tǒng)的損傷［15］。郭延平等［16－17］研究低溫脅迫下溫州蜜柑葉片光合作用與葉綠素熒光變化相關性時發(fā)現(xiàn)，溫度下降至3℃，F(xiàn)v/Fm下降，F(xiàn)o上升，T1/2降低，表明PSⅡ的光化學效率受到影響;在8℃處理18 h條件下，葉片葉綠素熒光變化不大;在2℃低溫處理15 h條件下，葉片葉綠素熒光參數(shù)Fo及Fv/Fm變化無顯著差異;然而自然低溫處理2、7 d，F(xiàn)v/Fm顯著降低，F(xiàn)o明顯上升;放置室內20℃下，F(xiàn)v/Fm和Fo恢復較快。

目前，許多學者將葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm作為植物抗寒性的主要敏感指標，用于玉米、花旗松、長豇豆等多種植物的抗寒性鑒定中［18－20］。此外另一參數(shù)Fv/Fo則被認為是鑒定番茄抗冷性一個快速、靈敏和可靠的指標［21］。葉綠素熒光技術已被廣泛用于抗凍性植物的篩選，它不但可以快速獲得植物不同部位的抗凍性，而且還可以推測出它適合種植的地區(qū)范圍，為植物引種馴化及新品種的推廣提供方便。

1．1．3．2 高溫脅迫。對于高溫脅迫，許多學者認為它主要是破壞了植物的光系統(tǒng)，表現(xiàn)在光系統(tǒng)量子產率Fv/Fm下降，F(xiàn)o升高。喻方圓等［22］在3個周期水分和熱脅迫處理下對杉木、馬尾松和北美喬柏等苗木的葉綠素熒光變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)熱脅迫下3個樹種的Fv/Fm值變化顯著;就3個水分和熱脅迫周期處理來說，每個處理周期結束時杉木和馬尾松的Fv/Fm值變化不顯著;但隨著處理時間的增長，北美喬柏的Fv/Fm值顯著下降。張黎萍等［23］對小麥的研究表明，高溫脅迫處理可損傷小麥葉片光合膜特別是PSⅡ的結構和功能，降低了PSⅡ光能轉換效率，小麥旗葉Fv/Fm和ΦPSII值均降低。

高溫脅迫處理下，研究人員研究早熟的花椰菜、溫州蜜柑和臍橙葉片的葉綠素熒光時，均發(fā)現(xiàn)Fv/Fm下降，而且在番茄幼苗和黃瓜幼苗的研究中也得到同一結果，因而表明Fv/Fm 也是植物耐高溫脅迫的一個主要參數(shù)［4，24－25］。

1．1．4 水分脅迫。水分是植物生長發(fā)育的必要條件，它是決定植物系統(tǒng)生產率的首要因素。土壤中水分過少，滿足不了植物的生長需要，發(fā)生水分虧缺現(xiàn)象，即干旱脅迫;而水分過多，會造成植株根際缺氧，產生澇害，植物生長不好或爛根死苗。

1．1．4．1 干旱脅迫。干旱脅迫是植物逆境的一種形式，它影響植物的生長和發(fā)育。植物生長在一定的條件下，當蒸騰消耗的水分超過吸收時，體內水分將虧缺，這一現(xiàn)象稱為干旱脅迫。干旱脅迫會導致植物光合器官受到傷害，光合能力受到抑制。賈利強等［26］在模擬干旱條件下，研究了黃連木和清香木幼苗的葉片相對含水量(RWC)、光合色素含量和葉綠素熒光參數(shù)的變化，并統(tǒng)計了處理后幼苗的生存率。試驗結果表明:在干旱處理前期，2樹種幼苗葉片RWC、Fv/Fm相對值和Fo相對值變化平緩;當?shù)礁珊堤幚砗笃跁r，2個樹種幼苗葉片的RWC、Fv/Fm相對值快速下降，F(xiàn)o相對值快速上升。羅俊等［27］研究干旱對甘蔗苗期的影響時，發(fā)現(xiàn)Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、Rfd隨干旱脅迫強度的增強而下降，變化幅度與甘蔗抗旱性的強弱相關，并建議用丙二醛(MDA)含量、Fv/Fm、Yield、Rfd這4個指標的變化來鑒定甘蔗抗旱性。

1．1．4．2 水澇脅迫。水澇脅迫也稱澇害，是土壤含水量過大，導致氧氣不足而使植物受到損害，它是植物遭遇的最主要逆境之一。現(xiàn)有研究表明，水澇脅迫損傷或破壞葉綠體光合機構、損傷PS放氧復合物和導致葉片qN上升等變化。在水澇脅迫處理杉木、馬尾松和北美喬柏的研究中，發(fā)現(xiàn)3種樹木Fv/Fm變化不同:經處理后北美喬柏的Fv/Fm值明顯降低，杉木的Fv/Fm值稍微下降，而馬尾松的Fv/Fm值變化不顯著［22］。李娟娟等［28］在研究淹水脅迫對丁香的影響時，發(fā)現(xiàn)隨著脅迫時間的延長，葉片的Fo和qN明顯上升，F(xiàn)m、Fv/Fm、Fv/Fo均呈顯著降低趨勢，3種丁香中小葉丁香變化幅度最小，對淹水的抗性最大。

1．1．5 營養(yǎng)脅迫。N、P和K以及微量元素等營養(yǎng)物質的失衡都會限制植物生長，植物的這些變化與光合作用密切相關。郭盛磊等［29］探討了N、P營養(yǎng)缺乏對落葉松幼苗光合的影響，在N素供應小于1 mmol/L時，葉片全N、葉綠素含量和凈光合速率顯著降低，分別下降37%、31%和59%，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo分別下降了22%和57%;而P素供應小于0．125 mmol/L時，葉片全N和全P含量、可溶性蛋白含量和Fv/Fm與對照比差別不顯著，F(xiàn)v/Fo下降13%。聶磊等［30］對不同環(huán)境下的沙田柚葉綠素熒光參數(shù)展開研究，發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)富足的果園Fv/Fm和ΦPSII較高，F(xiàn)v/Fm與葉片中N、K、Mn含量有極顯著正相關，與Mg、Cu含量也有顯著正相關，F(xiàn)v/Fm可以作為衡量營養(yǎng)水平的指標。

吳曉艷等［31］研究6種山崎營養(yǎng)液濃度(1/12 s、1/10 s、1/8 s、1/4 s、1/2 s和1 s)對鴨兒芹幼苗生長及葉綠素熒光參數(shù)的影響，結果表明在1/8 s濃度下各生長因子均達到最大，F(xiàn)o值最小，F(xiàn)m、Fv/Fm、Fv/Fo值最大。這說明營養(yǎng)液濃度對鴨兒芹幼苗有雙重作用，低濃度下隨著營養(yǎng)液濃度的升高，有利于幼苗生長;超過最適濃度后濃度升高，對植株營養(yǎng)脅迫逐漸增強，抑制幼苗生長。范燕萍等［32］研究N素對匙葉天南星生長及光合特性的影響時，在0～16 mmol/L N素范圍內，隨著濃度的升高，ΦPSII的活性也隨之升高;當超過16 mmol/L后，ΦPSII的活性下降。Fv/Fm和qP也表現(xiàn)出同樣的變化。

因此，可以利用葉綠素熒光技術快速地測定植株光合作用的變化，從而找到植物生長發(fā)育最適宜的營養(yǎng)環(huán)境，指導實踐生產。

1．1．6 其他脅迫。張放等［33］在 400 μmol/mol 和 700 μmol/mol CO2下，研究水分脅迫2年生“大紅袍”枇杷葉綠素熒光等生理變化，結果表明高濃度的CO2對水分脅迫下的枇杷葉片Pn均有明顯的促進作用，F(xiàn)v/Fm，F(xiàn)v/Fo和ΦPSII值明顯提高。研究汽車尾氣對4種樹的影響時，馬樹華等［34］測試了五角槭、山荊子、山梨和茶條槭葉綠素熒光參數(shù)，發(fā)現(xiàn)隨著熏氣時間的增長和熏氣濃度的變大，它們的熒光參數(shù)Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII、qP均慢慢下降，qN則逐步上升，其中茶條槭的變化幅度最小，抗污染脅迫能力最強。研究病害脅迫對植物的影響，人們發(fā)現(xiàn)感染炭疽病的枇杷和生條銹病的冬小麥葉片的Fv/Fm等參數(shù)明顯下降，這表明植物對病原菌的抗性與葉片葉綠素熒光的某些參數(shù)有關［5］。

2．2 優(yōu)良品種選育 光合作用是植物生產的基礎，植物干物質的90%以上來自光合作用，因此選擇光能利用效率高的品種對植物育種有著現(xiàn)實意義。植物葉片吸收光能，以熱、熒光和光合作用3種途徑相互競爭，利用葉綠素熒光測定技術可直接或間接了解光合作用過程。徐崇志等［35］研究了新疆5個核桃品種的葉綠素熒光參數(shù)日變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同品種間熒光參數(shù)對光強和溫度的響應存在著明顯差異。通過對堅果外觀品質和熒光參數(shù)的綜合分析，結果表明溫138和新翠豐2個品種有較好的脅迫耐受性，是現(xiàn)有主栽品種的優(yōu)良后備種質。唐禮俊等［15］研究不同地區(qū)華山松的葉綠素熒光參數(shù)時，發(fā)現(xiàn)Fv/Fm、Fv/Fo、Fm/Fo有明顯的地理變異，并與華山松的生長量呈正相關。這一結果表明較高的生長速率是與較高的光能轉化效率和較高的PSⅡ潛在活力緊密相關，與徐德聰?shù)龋?6］對美國山核桃葉綠素熒光特性的研究結果相一致。李潮海等［9］在研究不同產量的玉米雜交種生育后期的光合效率時，認為玉米雜交種的產量差異不僅與葉面積的發(fā)展動態(tài)有關，還與葉片自身的光合特性有關。雜交種產量高，就有較高的Fv/Fm和ΦPSII及較低的NPQ［9］。這些研究結果均表明葉綠素熒光可以靈敏地反映植物體的生長發(fā)育狀況，從而可以成為預測植株生長重要指標。

3 展望

植物葉綠素熒光分析技術是近年發(fā)展起來的用于光合作用機理研究和光合生理狀況檢測的一種新技術，它具有反映“內在性”的特點，因而被視為研究植物光合作用與環(huán)境關系的內在指針。它幾乎可以反映所有環(huán)境因子對植物(包括浮游植物)的影響以及植物生理功能在不同水平上的變化，因此這一技術必將被更廣泛地應用于植物光合機制、植物病理學、環(huán)境脅迫以及林木遺傳改良等研究領域。

［1］馬建偉，張宋智，王軍輝，等．17種植物葉片葉綠素熒光特性分析［J］．甘肅林業(yè)科技，2009，34(3):1 －4．

［2］張守仁．葉綠素熒光動力學參數(shù)的意義及討論［J］．植物學通報，1999，16(4):444－448．

［3］田海濤．3種經濟竹種葉綠素熒光特性研究［D］．臨安:浙江林學院，2007．

［4］許大全．光合作用效率［M］．上海:上?？茖W技術出版社，2002:29－35．

［5］陳建明，俞曉平，程家安．葉綠素熒光動力學及其在植物抗逆生理研究中的應用［J］．浙江農業(yè)學報，2006，18(1):51 －55．

［6］馮志立，馮玉龍，曹坤芳．光強對砂仁葉片光合作用光抑制及熱耗散的影響［J］．植物生態(tài)學報，2002，26(1):77 －82．

［7］劉建福．澳州堅果葉片光合速率和葉綠素熒光參數(shù)日變化［J］．西南農業(yè)大學學報，2006，28(2):271 －274．

［8］湯照云，萬國強，劉吉妍，等．北疆主要棉花品種葉綠素熒光參數(shù)的特性［J］．石河子大學學報，2004，22(2):107 －109．

［9］李潮海，劉奎．不同產量水平玉米雜交種生育后期光合效率比較分析［J］．作物學報，2002，28(3):379 －383．

［10］李霞，劉友良，焦德茂．不同高產水稻品種葉片的熒光參數(shù)的日變化和光適應特性的關系［J］．作物學報，2002，28(2):145 －153．

［11］馬翠蘭，劉星輝，王湘平．鹽脅迫下柚實生苗生長、礦質營養(yǎng)及離子吸收特性研究［J］．植物營養(yǎng)與肥料學報，2004(3):319－323．

［12］梁海永，李會平，鄭均寶，等．NaCl脅迫對歐洲黑楊組培植株葉片光系統(tǒng)Ⅱ功能的影響［J］．河北林果研究，2000，15(2):101 －104．

［13］彭建云．不同抗鹽性小麥品種葉綠素熒光特性與其抗鹽性關系的研究［D］．濟南:山東師范大學，2008．

［14］溫國勝，田海濤，張明如，等．葉綠素熒光分析技術在林木培育中的應用［J］．應用生態(tài)學報，2006，17(10):1973 －1977．

［15］唐禮俊，李渤生，唐崇欽，等．華山松葉綠素熒光誘導動力學參數(shù)的地理差異及其與樹高生長的關系［J］．植物生態(tài)學報，1997，21(5):474－479．

［16］郭延平，張良誠，沈允鋼．低溫脅迫對溫州蜜柑光合作用的影響［J］．園藝學報，1998，25(2):111 －116．

［17］郭延平，張良誠，洪雙松，等．溫州蜜柑葉片氣體交換和葉綠素熒光對低溫的響應［J］．植物生理學報，2000，26(2):88 －94．

［18］YING J，LEE E A，TOLLENAAR M．Response of maize leaf photosynthesis to low temperature during the grain filling period［J］．Field Crops Res，2000，68(2):87 －96．

［19］PERKS M P，OSBORNE B A，MITCHELL D T．Rapid predictions of cold tolerance in Douglas fir seedlings using chlorophyll fluorescence after freezing［J］．New Forests，2004，28(1):49 －62．

［20］李國景，劉永華，吳曉花，等．長豇豆品種耐低溫弱光性和葉綠素熒光參數(shù)等的關系［J］．浙江農業(yè)學報，2005，17(6):359 －362．

［21］王可玢，趙福洪，王孝宣，等．用體內葉綠素a熒光動力學鑒定番茄的抗冷性［J］．植物學通報，1996，13(2):29 －33．

［22］喻方圓，GUY R D．水分和熱脅迫處理對三個針葉樹種苗木葉綠素熒光的影響［J］．Journal of Forestry Research，2004，15(1):24 －28．

［23］張黎萍，荊奇，戴廷波，等．溫度和光照強度對不同品質類型小麥旗葉光合特性和衰老的影響［J］．應用生態(tài)學報，2008，19(2):311 －316．

［24］劉愛榮，陳雙臣，王淼博，等．高溫脅迫對番茄幼苗光合作用和葉綠素熒光參數(shù)的影響［J］．西北農業(yè)學報，2010，19(5):145 －148．

［25］張紅梅，金海軍，丁小濤，等．黃瓜幼苗對熱脅迫的生理反應及葉綠素熒光特性［J］．上海交通大學學報:農業(yè)科學版，2011，29(5):61 －66．

［26］賈利強，李吉躍，郎南軍，等．水分脅迫對黃連木、清香木幼苗的影響［J］．北京林業(yè)大學學報，2003，25(3):55 －61．

［27］羅俊，張木清，林彥銓，等．甘蔗苗期葉綠素熒光參數(shù)與抗旱性關系研究［J］．中國農業(yè)科學，2004，37(11):1718 －1721．

［28］李娟娟，許曉妍，朱文旭，等．淹水脅迫對丁香葉綠素含量及熒光特性的影響［J］．經濟林研究，2012，30(2):43 －47．

［29］郭盛磊，閻秀峰，白冰，等．落葉松幼苗光合特性對氮和磷缺乏的響應［J］．應用生態(tài)學報，2005，16(4):589 －594．

［30］聶磊，李淑儀，廖新榮，等．沙田柚葉綠素熒光特性及其與葉片礦質元素含量的關系［J］．果樹科學，1999，24(4):123 －126．

［31］吳曉艷，周守標，程龍玲，等．營養(yǎng)液對鴨兒芹幼苗生長、抗氧化酶活性及葉綠素熒光參數(shù)的影響［J］．植物營養(yǎng)與肥料學報，2012，18(4):1026 －1034．

［32］范燕萍，余讓才，陳建勛，等．氮素營養(yǎng)脅迫對匙葉天南星生長及光合特性的影響［J］．園藝學報，2000，27(4):297 －299．

［33］張放，陳丹，張士良，等．高濃度CO2對不同水分條件下枇杷生理的影響［J］．園藝學報，2003，30(6):647 －652．

［34］馬樹華，王慶成，李亞藏．汽車尾氣對四種北方闊葉樹葉綠素熒光特性的影響［J］．生態(tài)學雜志，2005，24(1):15 －20．

［35］徐崇志，全紹文，朱玲，等．不同核桃品種葉綠素熒光動力學參數(shù)比較研究［J］．中國農學通報，2015，31(7):6 －12．

［36］徐德聰，呂芳德，栗彬，等．不同品種美國山核桃葉綠素熒光特性的比較［J］．果樹學報，2008，25(5):671 －676．