烏鱧分泌多糖和黏多糖的提取及其抗氧化活性研究*

孫麗平，鮑長俊，柳建華，蘇雪嬌，孫云

(昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南 昆明，650500)

烏鱧(Channa argus)，俗稱黑魚、烏魚等，隸屬于鱸形目、攀鱸亞目、醴科、醴屬，是我國珍貴的本土經(jīng)濟(jì)魚類資源。烏鱧肉質(zhì)脆嫩、骨刺少，味道鮮美，是我國兩廣、云貴等地喜愛煮食的魚類，兩廣地區(qū)民間更是將其用于外科傷愈食療補(bǔ)品，助傷口快速愈合。周光宇等［1］研究認(rèn)為，烏魚濃縮液對傷口組織的增生修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用，對因手術(shù)創(chuàng)傷和過氧化玉米油所致的脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)均有明顯的抑制作用。秦偉夫等［2］也發(fā)現(xiàn)，烏鱧復(fù)原湯對大鼠術(shù)后切口表現(xiàn)出顯著的促愈作用。聶興國等［3］、溫小波等［4］、姜巨峰等［5］先后對不同產(chǎn)區(qū)、不同種質(zhì)間、不同性別的烏鱧的營養(yǎng)成分進(jìn)行了分析比較。

研究表明在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一些內(nèi)源性多糖被證明具有抗凝血、改善微循環(huán)、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降血糖等功效，已經(jīng)開發(fā)使用的有肝素、透明質(zhì)酸、殼聚糖等［7］。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)動(dòng)物的皮、軟骨、分泌腺等器官富含具有生物活性的多糖，如董陸陸等［8］系統(tǒng)研究了泥鰍黏多糖的制取及其物化性質(zhì)。

本文擬以云南產(chǎn)鮮活烏鱧為原料，制取了烏鱧的分泌多糖和黏多糖，簡析其部分理化性質(zhì)，以期對烏鱧食補(bǔ)功效的物質(zhì)基礎(chǔ)有所認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活烏鱧(1 kg/條)，購于昆明市呈貢區(qū)某養(yǎng)殖場;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三吡啶三嗪(TPTZ)、1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radicals(DPPH)、Trolox、2，2-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid(ABTS)等色譜純試劑，購自Sigma試劑公司;D-(+)-葡萄糖(美國 Sigma)、D-(+)-葡萄糖醛酸(美國 Sigma)、D-(+)-半乳糖(美國 Sigma)、D-(+)-半乳糖胺鹽酸鹽(美國Sigma)、L-鼠李糖(美國Sigma)、L-(+)-阿拉伯糖(美國 Sigma)、D-(+)-半乳糖醛酸(德國 Ruibio)、D-(+)-葡萄糖胺鹽酸鹽(德國Ruibio)、D-甘露糖胺鹽酸鹽(德國Ruibio)、D-木糖(德國 Ruibio)、L-巖藻糖(德國 Ruibio)、D-甘露糖(美國Ameresco)等12種單糖標(biāo)準(zhǔn)品;三氟乙酸、乙腈，色譜純，購自Merck試劑公司;其他試劑均為分析純。

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;3K15型通用臺式冷凍離心機(jī)，德國SIGMA公司;ALPHA1-2/LD型冷凍干燥機(jī)，德國CHRIST公司;TU-1901雙光束紫外可見光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Agilent1200高效液相色譜儀，美國Agilent公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的制備

1.2.1.1 烏鱧分泌多糖的制備

將鮮活烏鱧用清水浸養(yǎng)，每隔12 h換水1次，收集浸養(yǎng)水，浸養(yǎng)72 h后用刀背重?fù)魹貅k頭部致死，刮下魚體表面黏液并收集。將浸養(yǎng)水真空濃縮至1 L，合并魚體表面黏液后，加入4倍體積無水乙醇，不斷攪拌1 h后4℃靜置12 h，6 000 r/min離心15 min，收集沉淀，用無水乙醇洗滌2～3次，少量蒸餾水溶解，Savge法除蛋白，重復(fù)5次，回收水溶液，凍干，得烏鱧分泌多糖粗提物［6］。

1.2.1.2 烏鱧黏多糖的制備

根據(jù)董陸陸等［8］和盧學(xué)根［9］方法，收集上述烏鱧的皮、鱗和骨等，60℃鼓風(fēng)干燥，粉碎，過20目篩。過篩干粉用石油醚回流脫脂，晾干，0.6%木瓜蛋白酶浸提(0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0，55℃，3h)，料液比為1∶15(g∶mL)，調(diào)節(jié) pH 8.0，再用0.3%堿性蛋白酶55℃浸提2 h，100℃滅酶5 min，冷卻后4 500 r/min離心15 min，收集上清液，調(diào)節(jié)pH 6.5，真空濃縮至100 mL后加入4倍體積的無水乙醇沉淀多糖，4 ℃靜置 12 h，6 000 r/min離心 15 min，收集沉淀，用無水乙醇洗滌2～3次，少量蒸餾水溶解，savge法除蛋白，重復(fù)5次，回收水溶液，凍干，得烏鱧黏多糖粗提物。

1.2.2 多糖含量測定及單糖組成分析

采用硫酸-苯酚法測定粗提物中多糖含量，0～100 μg/mL的葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，多糖含量表達(dá)為%粗提物。

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化反向高效液相色譜法［10］分析樣品中的單糖組成，每種單糖的含量表達(dá)為μg/mg粗提物。

1.2.3 多糖的體外抗氧化活性分析

1.2.3.1 還原能力測定

采用FRAP法測定多糖粗提物的還原能力［11］。

FRAP工作液的制備:300 mmol/L醋酸鹽緩沖液(3.1 g的乙酸鈉+16 mL冰乙酸，用蒸餾水定容到1 000 mL，pH 3.6)，10 mmol/L 的TPTZ 的40 mmol/L HCl溶液，20 mmol/L 的 FeCL3溶液，用時(shí)以 10∶1∶1的體積比混合，并37℃預(yù)熱備用。

量取0.15 mL稀釋為一定濃度梯度的多糖粗提物溶液，加入4.5 mL預(yù)熱至37℃的FRAP工作液，搖勻后，37℃水浴反應(yīng)10 min，于593 nm處測定反應(yīng)液吸光值，以蒸餾水代替樣品作為空白。以VC作為陽性對照，以0～1 000 μmol/L FeSO4-TPTZ復(fù)合物在593 nm處的吸光值為參考標(biāo)準(zhǔn)，多糖粗提物的還原能力以達(dá)到同樣吸光值所對應(yīng)的FRAP值(μmol/L FeSO4)來表示，F(xiàn)RAP值越大，還原能力越強(qiáng)。EC50值表示還原能力為500 μmol/L FeSO4時(shí)所對應(yīng)的多糖/VC濃度。

1.2.3.2 DPPH自由基清除能力測定

取0.4 mL稀釋為一定濃度梯度的多糖粗提物溶液，加入2 mL 0.1mmol/L DPPH甲醇溶液，混勻，暗處放置30 min并不斷震蕩，在517 nm處測其吸光值。以蒸餾水代替樣品作為空白。以VC作為陽性對照。清除率計(jì)算公式為:

清除率/%=(1-A樣/A對照)×100

IC50值表示清除率為50%時(shí)多糖/VC濃度。

1.2.3.3 羥自由基清除能力測定

取1 mL稀釋為一定濃度梯度的多糖粗提物溶液，依次加入0.3 mL 8 mmol/L的FeSO4，0.25 mL 20 mmol/L的 H2O2，lmL 3mmol/L水楊酸，混勻，37 ℃水浴30 min，取出，冷卻，加入0.45 mL的蒸餾水，混勻，2 000 r/min離心10 min，取上清液于510 nm測吸光度。以蒸餾水代替樣品作為空白。以VC作為陽性對照。清除率計(jì)算公式為:

清除率/%=(1-A樣/A對照)×100

IC50值表示清除率為50%時(shí)多糖/VC濃度。

1.2.3.4 ABTS自由基清除能力測定

參照 Ozgen等［12］的方法，將 5 mL 7 mmol/L ABTS和88 μL的140 mmol/L過硫酸鉀混合，在室溫，避光的條件下靜置12 h，形成ABTS自由基儲備液。該儲備液在室溫，避光的條件下穩(wěn)定。使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在30℃下、734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02。

取0.5 mL一定濃度梯度的多糖提取液，加入4 mL ABTS工作液充分混合10s，30℃水浴6 min，于734 nm波長處測吸光度。0.5 mL無水乙醇+4 mL ABTS工作液，在0 min時(shí)的吸光值為對照，0.5 mL水+4 mL無水乙醇為空白調(diào)零。以Trolox作為陽性對照。清除率計(jì)算公式為:

ABTS清除率/%=［(A對照-(A樣-A樣對照))/A對照］×100

IC50值表示清除率為50%時(shí)多糖/Trolox濃度。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少3次重復(fù)，測定結(jié)果表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、畫圖及回歸分析。采用SPSS11.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，差異顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖粗提物中多糖含量及其單糖組成

實(shí)驗(yàn)制取得到烏鱧分泌多糖和粘多糖粗提物干品分別為384 mg和500 mg。經(jīng)硫酸-苯酚法測定兩類多糖粗提物中分泌多糖含量較高，為66.5%，粘多糖含量為37.9%。對樣品水解、衍生后分析其單糖組成，結(jié)果如表1所示。

表1 烏鱧分泌多糖和黏多糖的單糖組成Table 1 Monosaccharide compositions of the secretion of polysaccharide and mucopolysaccharide from Channa argus

由表1可知，烏鱧分泌多糖主要由半乳糖382.0 μg/mg、阿拉伯糖353.0 μg/mg 和鼠李糖87.7 μg/mg組成，此外還含有少量的甘露糖25.3 μg/mg，單糖測定量總和為848 μg/mg，即分泌多糖粗提物中糖含量為84.8%，高于硫酸-苯酚法測定的66.5%，這可能是因?yàn)榱蛩?苯酚法測定糖含量時(shí)，在測定條件下硫酸不能完全水解多糖脫水生成糠醛衍生物，而導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。黏多糖的單糖組成較為復(fù)雜，根據(jù)本研究中12種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜，可以定性和定量的單糖有葡萄糖醛酸 88.6 μg/mg、葡萄糖胺 78.8 μg/mg、半乳糖 63.9 μg/mg、半乳糖醛酸 44.3 μg/mg、木糖39.4 μg/mg、葡萄糖 22.0 μg/mg、鼠李糖 16.4 μg/mg、甘露糖 7.8 μg/mg、阿拉伯糖 7.4 μg/mg，單糖測定量總和為 368.6 μg/mg(36.8%)，與硫酸-苯酚法測定的37.9%相當(dāng)。研究條件所限，樣品圖譜在半乳糖胺出峰時(shí)間處雜峰較多，不能對半乳糖胺進(jìn)行有效的定性和定量分析，本研究也未對含硫的單糖進(jìn)行分析。研究表明動(dòng)物內(nèi)源性多糖，特別是水產(chǎn)多糖可由含氮、含硫等單糖衍生物組成［8，13］。

2.2 多糖粗提物的抗氧化活性

天然的抗氧化劑在慢性和急性疾病的預(yù)防中發(fā)揮重要作用，植物、真菌、動(dòng)物等來源的多糖已被證明是有效天然抗氧化活性物質(zhì)，廣泛應(yīng)用在藥物和功能性食品中，可以改善人體中抗氧化酶的活性，清除自由基，抑制脂質(zhì)體氧化［14-15］。

2.2.1 多糖粗提物的還原能力

采用FRAP法測定的抗氧化物質(zhì)的還原能力也被稱為總抗氧化能力［11］，所以物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)，其抗氧化活性也越高。烏鱧分泌多糖和黏多糖粗提物的還原能力及其與質(zhì)量濃度相關(guān)性分析如圖1所示。

圖1 烏鱧分泌多糖(a)和黏多糖粗提物(b)的還原能力及其與質(zhì)量濃度相關(guān)性Fig.1 Reducing power of the secretion of polysaccharide and mucopolysaccharide from Channa argus，and the correlation between polysaccharide contents and reducing power

烏鱧分泌多糖和黏多糖粗提物均表現(xiàn)出一定的還原能力，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，統(tǒng)計(jì)分析顯著正相關(guān)(P＜0.05)。但是2種多糖在其測定濃度范圍內(nèi)均未達(dá)到500 μmol/L FeSO4所對應(yīng)的FRAP值。相同測定條件下，VC的EC50值為1.1 μg/mL。本研究測定結(jié)果與楊娜等［11］的報(bào)道一致，多糖具有較好的還原能力，但是要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VC、酚類［16］等小分子抗氧化劑。

2.2.2 多糖粗提物對DPPH自由基的清除活性

烏鱧分泌多糖粗提物對DPPH自由基表現(xiàn)出一定的清除活性，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，統(tǒng)計(jì)分析顯著正相關(guān)(P＜0.05);黏多糖粗提物對DPPH自由基的清除活性較弱。如圖2所示。

圖2 烏鱧分泌多糖(a)和黏多糖粗提物(b)的DPPH清除活性及其與質(zhì)量濃度相關(guān)性Fig.2 DPPH-scavenging activity of the secretion of polysaccharide and mucopolysaccharide from Channa argus，and the correlation between polysaccharide contents and DPPH-scavenging activity

本研究中多糖對DPPH自由基的清除活性顯著低于許明峰等［17］和楊娜等［11］的報(bào)道，這可能是本研究中測定用多糖濃度太低，測定濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率最高為25.8%和16.8%，未達(dá)到50%。相同測定條件下，VC的IC50值為3.1 μg/mL。

2.2.3 多糖粗提物對羥自由基的清除活性

羥自由基(·OH)是所有ROS中最活躍的自由基，能殺死紅細(xì)胞，降解DNA、細(xì)胞膜，損傷生命體。本研究中烏鱧分泌多糖和黏多糖粗提物均表現(xiàn)出顯著的羥自由基清除活性，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，統(tǒng)計(jì)分析顯著正相關(guān)(P＜0.05)，如圖3所示。兩類多糖提取物對羥自由基清除活性的IC50值分別是2.4 mg/mL和1.1 mg/mL，陽性對照VC的IC50值為16.1 μg/mL。本研究制取的兩類多糖對羥自由基的清除活性與張艷萍等［18］和楊娜等［11］研究的一些植物源多糖對羥自由基的清除活性相當(dāng)。相同質(zhì)量濃度下，黏多糖對羥自由基的清除活性高于分泌多糖。

2.2.4 多糖粗提物對ABTS自由基的清除活性

如圖4所示，在本研究的4個(gè)抗氧化性能測定體系中，烏鱧分泌多糖對ABTS自由基的清除效果最為顯著，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，統(tǒng)計(jì)分析顯著正相關(guān)(P＜0.05)，IC50值為0.2 mg/mL，顯著高于白海娜等［19］研究報(bào)道的黑木耳多糖對ABTS自由基的清除活性。黏多糖也表現(xiàn)了量-效顯著正相關(guān)的ABTS自由基清除活性，但是其清除效果較低，測定濃度范圍內(nèi)的最大清除率為14.8%。

圖3 烏鱧分泌多糖(a)和黏多糖粗提物(b)的羥自由基清除活性及其與質(zhì)量濃度相關(guān)性Fig.3 OH-scavenging activity of the secretion of polysaccharide and mucopolysaccharide from Channa argus，and the correlation between polysaccharide contents and OH-scavenging activity

圖4 烏鱧分泌多糖(A)和黏多糖粗提物(B)的ABTS清除活性及其與質(zhì)量濃度相關(guān)性Fig.4 ABTS-scavenging activity of the secretion of polysaccharide and mucopolysaccharide from Channa argus，and the correlation between polysaccharide contents and ABTS-scavenging activity

3 結(jié)論

本文制取了2種烏鱧多糖物質(zhì)，測定了其單糖組成和含量，2種多糖表現(xiàn)出較好的體外抗氧化性能。因此，多糖可能是烏鱧對人體外傷愈合及其他食補(bǔ)功效的部分物質(zhì)基礎(chǔ)，其構(gòu)效關(guān)系及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步研究。

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