天山一號冰川融水中耐冷酵母菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育*

鄭曉吉，孫海龍，關(guān)波，姜遠(yuǎn)麗，倪永清

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子，832000)

地球上超過80%的環(huán)境溫度周期性或永久地低于5℃，如深海(90%的海洋溫度低于5℃)、海冰、南北兩極及高山荒漠、冰川和凍土。其中山岳冰川最大特點(diǎn)是常年存在大量的冰塊，溫度始終在0℃以下，上世紀(jì)末以來科學(xué)家發(fā)現(xiàn)冰川中蘊(yùn)藏著豐富的嗜冷真核和原核微生物資源，包括古菌、細(xì)菌、藍(lán)藻、酵母、絲狀真菌、藻類和原生生物等，并對微生物的嗜冷機(jī)制，包括不飽和脂肪酸、冷沖擊蛋白、熱激蛋白和低溫酶等進(jìn)行了深入研究［1］。

酵母菌作為一類重要的微生物資源，在食品、醫(yī)藥、發(fā)酵工業(yè)、飲料生產(chǎn)等行業(yè)被廣泛應(yīng)用。Lachance等人發(fā)現(xiàn)，酵母菌是營養(yǎng)代謝極其多樣的一類真核微生物，在自然界差異明顯的微環(huán)境中，能夠利用不同的底物，展現(xiàn)出極強(qiáng)的生存能力，甚至進(jìn)化出比細(xì)菌更好的適應(yīng)低溫環(huán)境的能力［2］。因此，充分研究極端低溫環(huán)境中嗜冷酵母菌資源，對認(rèn)識(shí)生物的進(jìn)化機(jī)制、物種多樣性以及開發(fā)其生物技術(shù)利用潛力具有重要的意義。Pietro等人概述了全球嗜冷酵母的分布和嗜冷機(jī)制，對南極洲、北極、南美洲、歐洲冰川、亞洲和喜馬拉雅地區(qū)的低溫酵母菌有了詳細(xì)的報(bào)道，并且開發(fā)了它們的生物技術(shù)潛力，特別是冷活性酶的來源和生物降解的能力。目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)記述的低溫酵母菌超過120種(其中子囊菌20種，擔(dān)子菌102種和類酵母2種)，大約1/3的菌株屬于隱球菌屬，而且每年不斷有許多新種發(fā)現(xiàn)［1］。

我國冰川凍土資源非常豐富，對這些低溫環(huán)境中細(xì)菌的多樣性已有較多報(bào)道［3-4］，但對低溫環(huán)境中生存的酵母菌等真核微生物資源的研究非常少，這對全面認(rèn)識(shí)地球上極端環(huán)境微生物的物種多樣性，尤其是酵母菌物種多樣性、生態(tài)分布特征是一個(gè)缺憾。隨著全球氣候變暖，冰川持續(xù)退縮，嗜冷微生物的生存環(huán)境不斷遭到破壞，開發(fā)和認(rèn)識(shí)這些低溫微生物迫在眉睫。

天山烏魯木齊河源一號冰川是我國在冰川水文、氣候變化、生態(tài)退縮等基礎(chǔ)研究方面最為詳盡的冰川。本研究從天山一號冰川底部沉積層空水及融水中分離篩選耐低溫酵母菌菌株，通過分子生物學(xué)方法揭示菌株的物種多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，了解其生態(tài)生理及產(chǎn)胞外酶特征，以期為后續(xù)研究開發(fā)低溫酵母菌的生物技術(shù)利用潛力奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器

用于PCR擴(kuò)增的全套試劑及擴(kuò)增引物均購自TaKaRa公司;相關(guān)生理生化試驗(yàn)所用試劑均購自于天津市巴斯夫化學(xué)試劑廠及天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑廠。高速冷凍離心機(jī)(Fresco21)，Thermo公司;PCR儀(Tprofessional)，德國 Biometra公司;水平電泳儀(PowerPac Universal)，美國 BioRad公司;凝膠成像系統(tǒng)(Gel DOC XR)，BioRad公司;電泳槽SUBCELL GT(20 cm ×25 cm)。

1.1.2 培養(yǎng)基

①分離培養(yǎng)基(RB):瓊脂15 g/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，氯霉素0.1 g/L，Dichloran溶液1 mL/L(濃度:每10 mL蒸餾水中Dichloran 0.2 g);Rose Bengal溶液0.5 mL/L(濃度:每10 mL蒸餾水中Rose Bengal 0.5 g)，pH調(diào)至5.6。②基礎(chǔ)培養(yǎng)基(YEPD):麥芽浸膏30 g/L，蛋白胨0.5 g/L，瓊脂 15 g/L，pH 調(diào)至 5.6。③產(chǎn)酶培養(yǎng)基:低溫酵母產(chǎn)酶菌株的分離和培養(yǎng)根據(jù)Buzzini和 Martini的方法進(jìn)行［5］。

1.2 樣品采集

從烏魯木齊河源天山一號冰川站，海拔3 250 m以上區(qū)域(年平均地溫為-4.95℃)的高寒環(huán)境中采集冰川流動(dòng)和沉積兩種融水，溫度分別為1℃和1.5℃，將水樣迅速裝入己滅菌的廣口瓶內(nèi)，置于車載冰箱中保存。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即過濾并富集融水中微生物，過濾液于4℃保存?zhèn)溆?。以上所有過程均在無菌條件下完成。

1.3 菌株的分離和保藏

菌株分離采用酵母菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基［6］和分離培養(yǎng)基［7］。菌株分離方法:在超凈工作臺(tái)上用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾水樣，收集濾膜上的菌體。采用梯度稀釋平板涂布法分離水樣品中的可培養(yǎng)酵母。15℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待菌落長出后，根據(jù)菌落顏色、大小、形態(tài)等表型差異進(jìn)行初步分離，轉(zhuǎn)接劃線后，將所得純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到Y(jié)EPD斜面培養(yǎng)基中4℃?zhèn)溆?。已純化菌株保存于裝有20%滅菌甘油管的保藏管中，并存于-70℃冰箱保藏。

1.4 低溫酵母菌形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定

1.4.1 酵母菌形態(tài)特征

根據(jù)酵母菌分類學(xué)鑒定標(biāo)準(zhǔn)方法對供試菌株進(jìn)行鑒定［8］。

1.4.2 最適生長溫度的測定

將活化的酵母菌種以0.5 mL的接入量接入裝有5 mL的YEPD(pH 5.6)液體富集培養(yǎng)基中，分別在4、10、15、20及25℃的5個(gè)溫度梯度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，420 nm測OD值。

1.4.3 最適pH的測定

按10%接種量將酵母菌分別接種于pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5及7.0的7個(gè)梯度的50 mL YEPD 液體培養(yǎng)基中，15℃培養(yǎng)24 h后，420 nm測OD值。

1.4.4 耐鹽性

制備初始 NaCl含量為0.02、0.04、0.06、0.08、0.12和0.16 g/mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接入活化的酵母菌，10℃培養(yǎng)1周后，420 nm測OD值。

1.5 PCR擴(kuò)增及測序

1.5.1 總DNA提取

用Makimura等［9］方法提取菌株總DNA。

1.5.2 PCR擴(kuò)增26S rDNA D1/D2區(qū)基因［6］

采用酵母菌通用引物NL1(5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')和NL4(5'-TCC TCC GTC TAT TGA TAT GC-3')對26S rDNA D1/D2區(qū)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件［10］:95℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 40 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 30 s，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)在Bio-Rad iCycler Thermal Cycler上進(jìn)行。1.2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增效果和片段大小。

PCR產(chǎn)物用EZ-10 column PCR Product Purification kit(BIO BASIC INC，Canada)純化后，由上海生工生物科技有限公司采用ABI377 DNA自動(dòng)測序儀直接測序。

1.6 低溫酵母菌多樣性分析

供試菌株的測序結(jié)果用Chromas參照正反序列圖譜人工校對，校正后的26S rDNA D1/D2區(qū)序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST)［11］，比較供試菌株與已知酵母菌相應(yīng)序列的同源性。為進(jìn)一步顯示實(shí)驗(yàn)菌株與已知酵母菌的親緣關(guān)系及其分類地位，根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，下載相關(guān)酵母菌菌種的26S rDNA D1/D2區(qū)序列，與實(shí)驗(yàn)菌株序列一起用 Clustal X1.83軟件進(jìn)行匹配排列(align)［12］，用MEGA 4.1軟件中的neighbor-joining分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1 000次Bootstraps檢驗(yàn)。

1.7 產(chǎn)酶菌株MSP-PCR指紋圖譜分析

采用單引物M13(5'-GAG GGT GGC GGT TCT-3')進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增［13］，擴(kuò)增條件［12］:95℃ 預(yù)變性 5 min，93 ℃變性45 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸6 min。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠、0.5×TBE電泳緩沖液、80 V/cm條件下電泳檢測4 h。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物指紋帶譜的有無，再統(tǒng)計(jì)分析將條帶轉(zhuǎn)化為只含有1和0兩值變量的矩陣，使用NTSYS-pc 2.01(Applied Biostatistics，Inc)軟件采用非加權(quán)算術(shù)平均連鎖法(UPGMA，unweighted pair group method with arithmetic mean)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的細(xì)胞形態(tài)與最適生長溫度、pH、耐鹽性及菌落形態(tài)

實(shí)驗(yàn)從冰川融水水樣中篩選了68株純培養(yǎng)物，顯微鏡鏡檢顯示全為酵母。由圖1可見，在顯微鏡下，分離出的酵母菌具有明顯的細(xì)胞核，是典型的真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈球圓形或卵圓形，大小相差懸殊，細(xì)胞直徑在(1～5)μm×(5～30)μm。

依據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小以及細(xì)胞形態(tài)，篩選15株作為代表菌株做進(jìn)一步的研究(表1)。研究結(jié)果表明，在15株代表菌株中，4株菌最適生長溫度為20℃左右，在35℃停止生長，屬耐冷菌范疇;有5株菌最適生長溫度為15℃左右，生長溫度范圍在0～20℃，屬于專性嗜冷菌;其他6株菌在耐冷菌與專性嗜冷菌之間。根據(jù)最適pH實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本次研究的15株代表菌株的最適pH均為4.6～6.5。在耐鹽性研究中，產(chǎn)酶菌株大多數(shù)最大耐鹽度為6%，耐鹽性最高的菌株是BCY-4和BCY-10，在8%時(shí)仍可以生長，但生長緩慢，而其他大多數(shù)菌株在此濃度下基本停止生長。菌株BCY-1、BCY-3、BCY-5、BCY-9和BCY-10的菌落較小，為1～2 mm;其余的在2～4 mm。菌株BCY-3、BCY-7、BCY-13和 BCY-15的菌落顏色為橘黃色;BCY-3、BCY-7和BCY-9為紅色;BCY-4、BCY-5和BCY-6為黃色，其余均為白色。

圖1 酵母菌在熒光顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cellular morphology of yeast under the fluorescent microscope

表1 低溫酵母菌株的生長特性與形態(tài)特性Table 1 Growth characteristics and morphological characteristics of psychrophilic yeast

2.2 基于26S rDNA基因D1/D2區(qū)域序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 基于26S rDNA區(qū)域序列和neighbor-joining分析繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Based on the 26S rDNA regional sequence and neighbor-joining analysis rendering phylogenetic tree

根據(jù)鏡檢結(jié)果篩選的15株(3株來自流動(dòng)水樣，12株來自沉積水樣)具有代表性的菌株進(jìn)行了測序鑒定。鑒定結(jié)果顯示，15株酵母菌隸屬于擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)和子囊菌綱(Ascomycetes)2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類，共7個(gè)屬。子囊菌綱僅分離到BCY-12，屬于畢赤酵母屬(Pichia)，其余14株酵母均屬于擔(dān)子菌綱。在擔(dān)子菌綱中，隱球酵母屬(Cryptococcus)6株，所占比例最大，達(dá)到了40%，其次是紅酵母菌屬(Rhodotorula)2株和擲孢酵母屬(Sporobolomyces)2株，分別占13.3%。

2.3 低溫酵母菌的產(chǎn)酶形態(tài)及產(chǎn)酶情況

由表2可知，產(chǎn)酶菌株總數(shù)為38株，Cryptococcus屬產(chǎn)酶菌株所占比例最大，達(dá)到了48.57%，且Cryptococcus屬的菌株全部可以產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶。在本次研究中，分離到的酵母菌中能夠產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的菌株數(shù)量最多，且產(chǎn)酶菌落透明圈的半徑達(dá)到3～4 mm，除菌株BCY-4、BCY-10外，其他11菌株均產(chǎn)淀粉酶，占總菌株的73.33%;除菌株BCY-6外，其余均產(chǎn)蛋白酶，占總菌株的73.33%;其次產(chǎn)脂肪酶菌株為7 株，分別為 BCY-2、BCY-5、BCY-6、BCY-9、BCY-10、BCY-13和BCY-15，占總菌株的46.67%;產(chǎn)酯酶菌株為4株，分別為 BCY-1、BCY-3、BCY-4和 BCY-9，占總菌株的26.67%;產(chǎn)果膠酶菌株為BCY-1、BCY-9和BCY-15，占總菌株的20%;產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株為BCY-11和BCY-12，分別來自不同的屬，占總菌株的20%。

2.4 指紋圖譜與聚類分析

15株代表菌株，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)序列鑒定，隸屬于7個(gè)屬，為了進(jìn)一步鑒定產(chǎn)酶酵母的種間差異，采用MSP-PCR指紋圖譜技術(shù)對15株代表菌株做了進(jìn)一步的研究。圖3A為15株產(chǎn)酶菌株的指紋圖譜，15株菌株共出現(xiàn)16種不同的條帶，每個(gè)菌株產(chǎn)生的條帶數(shù)在1～10之間，圖3B為指紋圖譜聚類分析樹狀圖。經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)鑒定相似性較高的6株隱球酵母菌(Cryptococcus)條帶差異較大，聚為5個(gè)不同的群，在75%的相似水平上，BCY-6與BCY-8為一群，表型特征相近，說明BCY-6與BCY-8相似性較高，另外BCY-2與BCY-14，BCY-5與BCY-8的聚類分析圖顯示親緣關(guān)系相近;BCY-11(Cryptococcus festucosus)獨(dú)立存在于一個(gè)分支，說明BCY-11與其他菌株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表2 天山一號冰川可培養(yǎng)低溫酵母菌產(chǎn)酶情況Table 2 Enzyme production situation of Tianshan mountain glacier Psychrophilic cultivate yeasts

圖3 低溫酵母菌株的MSP-PCR指紋圖譜(A)與聚類分析樹狀圖(B)Fig.3 MSP-PCR fingerprint patterns(3A)and dendrogram obtained by UPGMA cluster analysis of the PCR data sets(3B)

3 討論

本研究從冰川中分別采集到流動(dòng)水和沉積水兩種融水樣品，共分離得到68株低溫酵母，選取代表性菌株15株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其中3株來自流動(dòng)水樣，12株來自沉積水樣，由于沉積水流速緩慢，且離冰川前沿較遠(yuǎn)，沉積的過程中積累了大量可供微生物代謝的營養(yǎng)物質(zhì)，所以沉積水中微生物種類與數(shù)量比流動(dòng)水中要多。待測菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中菌株的比對發(fā)現(xiàn)隸屬于7個(gè)屬(1個(gè)子囊菌屬和6個(gè)擔(dān)子菌屬)，隱球酵母屬(Cryptococcus)是一種機(jī)會(huì)致病性真菌，在本次所篩選的菌株中占到總數(shù)的40%，產(chǎn)低溫酶的比例最大，這一結(jié)果與其他地區(qū)分離出低溫酵母菌的優(yōu)勢菌種相一致［1-3］;其次是紅酵母菌屬(Rhodotorula)和擲孢酵母屬(Sporobolomyces)，分別占13.3%。26S rDNA 5'末端有一個(gè)長約600bp的 D1/D2序列，根據(jù)Petercon［20］對核苷酸序列可變區(qū)D2的多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)這一區(qū)域在同種間的該區(qū)域核苷酸的差異小于1%，而不同種之間的差異通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于這個(gè)數(shù)據(jù)，雖然同一系統(tǒng)發(fā)育類群的菌株其26S rDNA序列相似性很高，還應(yīng)該結(jié)合表型特征以及更精確的分子指紋技術(shù)來區(qū)分和篩選高效產(chǎn)酶菌株。如BCY-3與 BCY-7隸屬于 Rhodotorula屬，雖然其26S rDNA基因序列相似性極高，但表型特征有差異，產(chǎn)酶結(jié)果也不相同，尤其是26S rDNA序列同源性很高的Cryptococcus屬，依據(jù)MSP-PCR指紋技術(shù)明顯可區(qū)分為4個(gè)亞群，基本與其生理生化特征差異相一致，因此研究的6株隱球酵母菌很可能隸屬于4個(gè)種，這可能與不同菌株的不同生存環(huán)境有關(guān)，多種因素改變了菌株的生理生化和表型特征，但并沒有改變保守的、非蛋白質(zhì)編碼基因26S rRNA 基因［16］。觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，BCY-2、BCY-3、BCY-7、BCY-13和 BCY-15為橘黃色，BCY-9為紅色，BCY-4、BCY-5、BCY-6 和 BCY-8 為黃色，隱球酵母屬(Cryptococcus)以白色為主，Jong Kook Kim的研究指出，使用萃取法從冬孢酵母(Rhodosporidium sp.)［17］中提取β-胡蘿卜素，對提取色素及類胡蘿卜素等營養(yǎng)素將會(huì)有進(jìn)一步的開發(fā)研究，未來可能會(huì)運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中。

本研究對冰川中可培養(yǎng)酵母菌進(jìn)行了分離篩選，了解了冰川中低溫酵母菌的生長特性、系統(tǒng)發(fā)育和物種多樣性，并對其代表菌株能否產(chǎn)胞外酶進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可確定相應(yīng)酵母菌是否具有產(chǎn)胞外酶的能力，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)對低溫酵母菌的產(chǎn)酶活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與拓展，以及使用宏基因組學(xué)對冰川中低溫酵母菌的總DNA建立克隆文庫，以期更加準(zhǔn)確地了解極端環(huán)境中酵母菌的系統(tǒng)進(jìn)化地位。

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