HPVE6／E7mRNA與宮頸病變關(guān)系的研究進(jìn)展

王麗梅 徐 琳

1（云南省第一人民醫(yī)院 婦科，昆明650032）

2（昆明醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院婦科，昆明650032）

宮頸癌是全球女性第二大常見的惡性腫瘤，全世界每年約有50萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例，每年約有23萬(wàn)女性死于宮頸癌。其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家［1］。我國(guó)每年約有8萬(wàn)人死于宮頸癌，其死亡率為我國(guó)婦女惡性腫瘤第一位［2］。

經(jīng)過大量流行病學(xué)和病毒學(xué)研究證實(shí)，高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的首要因素。所以有效、積極地開展宮頸癌篩查，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)干預(yù)，能夠顯著降低宮頸癌的發(fā)病率。由于E6和E7是HPV的癌基因，其表達(dá)必須通過E6／E7mRNA。因此2006年歐洲生殖器感染和腫瘤研究組織（European Research Organiza-tionon Genital Infection and Neoplasia，EUROGIN）取得了共識(shí)，認(rèn)為HPV E6／E7mRNA檢測(cè)應(yīng)作為宮頸癌篩查的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容［3］。本文就HPV E6／E7mRNA與宮頸病變關(guān)系的研究進(jìn)展做一綜述。

1 HPVE6、E7mRNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展

到目前為止，美國(guó)FDA相繼批準(zhǔn)了4個(gè)宮頸癌高危HPV檢測(cè)，依次分別為基于雜交捕獲技術(shù)的Hybrid Capture 2，基于酶切信號(hào)放大技術(shù)的 Cervista HPV，基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的Cobas HPV，和基于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的Aptima HPV。前三種HPV檢測(cè)是檢測(cè)HPV DNA，屬于第一代的高危HPV病毒檢測(cè)方法。80% 以上的婦女一生中都會(huì)有HPV病毒感染，只有不到10%左右的HPV感染會(huì)發(fā)展為持續(xù)性感染。這些持續(xù)感染HPV的婦女則成為宮頸癌的高危人群。第一代的HPV DNA檢測(cè)，雖然有較高的臨床敏感性，但是，其特異性較低，這主要是因?yàn)?HPV DNA是結(jié)構(gòu)基因，一旦發(fā)生感染，就能被檢測(cè)到。而這些假陽(yáng)性結(jié)果，會(huì)給患者帶來不必要的心理壓力，以及由此帶來后續(xù)不必要的創(chuàng)傷性檢查。

研究表明，HPV早期編碼區(qū)E6、E7基因是病毒的兩個(gè)關(guān)鍵致癌基因［4］。其通過轉(zhuǎn)錄mRNA實(shí)現(xiàn)癌蛋白的表達(dá)，從而改變細(xì)胞正常代謝，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生病變直至癌變。在病毒感染的早期，病毒基因在細(xì)胞內(nèi)為游離狀態(tài)，此時(shí)E6、E7基因處于靜默期，不表達(dá)或低表達(dá)mRNA，一過性HPV感染大多處于這個(gè)階段。當(dāng)HPV病毒發(fā)生持續(xù)感染后，病毒基因和人類基因發(fā)生整合，利用宿主細(xì)胞大量轉(zhuǎn)錄mRNA、從而導(dǎo)致大量癌蛋白的表達(dá)。所以癌基因E6、E7的表達(dá)是宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌發(fā)生的必要步驟，其表達(dá)產(chǎn)物E6、E7蛋白是致癌的關(guān)鍵。所以檢測(cè)高危型HPV病毒的E6、E7mRNA相比檢測(cè)HPV DNA，可以更加精準(zhǔn)的篩查病變，有效降低對(duì)一過性感染的檢出率。

2 HPVE6、E7基因的致癌機(jī)理

HPV病毒屬于乳頭多瘤空泡病毒科病毒屬，是一種小型、無外包膜的環(huán)狀DNA病毒。包括3個(gè)部分：早期基因區(qū)（E）、晚期基因區(qū)（L）及長(zhǎng)控制區(qū)（LCR）。其中，早期基因區(qū)可以編碼 E1、E2、E6、E7等早期蛋白，E6、E7是主要的致癌基因；晚期基因區(qū)編碼的后期蛋白質(zhì)（L1和L2）病毒衣殼是結(jié)構(gòu)性的組成部分，在病毒顆粒自我組裝以及侵入目標(biāo)細(xì)胞時(shí)起協(xié)調(diào)和識(shí)別作用。

而早期區(qū)（E區(qū)）編碼蛋白基因中，由E6和E7基因編碼的致癌蛋白是導(dǎo)致宮頸上皮癌變的重要因子，這兩種蛋白通過抑制兩種主要抑癌蛋白p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）使被感染的細(xì)胞可無限增殖并惡性轉(zhuǎn)變。E6蛋白通過E6相關(guān)蛋白（E6-AP）介導(dǎo)與抑癌蛋白p53結(jié)合，經(jīng)過泛素途徑使其降解，使細(xì)胞繞過細(xì)胞周期G1／S和G2／M檢查點(diǎn)而轉(zhuǎn)向惡性增殖。另外，E6通過阻斷p53依賴的細(xì)胞凋亡途徑阻止細(xì)胞凋亡，使基因異常的細(xì)胞得以持續(xù)增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞永生化和宮頸癌的發(fā)生［5］。E7蛋白可特異性結(jié)合視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb），pRb最重要的功能是與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合形成特異性pRb／E2F復(fù)合物，后者可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，負(fù)向調(diào)控G1／S期的轉(zhuǎn)變，抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展。E7蛋白特異性結(jié)合pRb后導(dǎo)致pRb／E2F復(fù)合物無法形成，從而促進(jìn)G1／S期的轉(zhuǎn)變和細(xì)胞分裂增殖加速［6］。

此外，E7蛋白也可使細(xì)胞周期相關(guān)負(fù)向調(diào)節(jié)因子p27和p16失活，使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯信號(hào)受到抑制，造成細(xì)胞周期紊亂，引起細(xì)胞無限增殖并向惡性轉(zhuǎn)化。E6、E7聯(lián)合作用可使有絲分裂紡錘體形成缺陷和中心體數(shù)目異常，導(dǎo)致染色體異常、基因不完整以及多倍體細(xì)胞的出現(xiàn)，促使細(xì)胞惡變和腫瘤的發(fā)生。有研究［7］表明：通過干擾RNA沉默E6、E7基因可抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并引起癌細(xì)胞凋亡；此外，HPV E6和E7癌基因在宮頸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起著重要作用，E6和E7與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）密切相關(guān)。EMT是惡性腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，通過下調(diào)黏附分子的表達(dá)使細(xì)胞間接觸力降低同時(shí)細(xì)胞流動(dòng)性增強(qiáng)，使惡性腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。E6和E7通過激活EMT轉(zhuǎn)錄因子Slug、Twist、ZEB1和ZEB2，使細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變，增強(qiáng)惡性細(xì)胞的侵襲力，使惡性細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移［8］。同時(shí)，E6和E7還可影響宿主的免疫功能，抑制干擾素應(yīng)答啟動(dòng)，導(dǎo)致病毒逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［9］。

3 HPVE6／E7mRNA在低度宮頸病變中的應(yīng)用

目前，HPV檢測(cè)大多數(shù)針對(duì)病毒DNA，HPV DNA檢測(cè)用于宮頸癌篩查的敏感度和特異性都高于細(xì)胞學(xué)檢查。美國(guó)陰道鏡和宮頸病理學(xué)會(huì)定期用HPV-DNA分型檢測(cè)對(duì)30歲以上的婦女進(jìn)行宮頸癌篩查。發(fā)現(xiàn)HPV-DNA分型檢測(cè)過程中出現(xiàn)較高的假陰性現(xiàn)象，而且假陰性現(xiàn)象隨著年齡增長(zhǎng)而增加［10］。因此，HPV DNA檢測(cè)對(duì)宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)過早。而癌基因E6和E7的表達(dá)是導(dǎo)致宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并發(fā)展至宮頸癌的必要步驟，相對(duì)于HPV DNA檢測(cè)，E6／E7mRNA檢測(cè)能夠更精確地預(yù)測(cè)細(xì)胞向高度病變和癌癥轉(zhuǎn)變的可能性。研究證實(shí)HPV的基因表達(dá)只有一條途徑（先轉(zhuǎn)錄，再翻譯），轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物E6／E7mRNA反映了基因表達(dá)的活性，因此，檢測(cè)E6／E7mRNA是了解HPV表達(dá)情況的有效途徑，其將是研究宮頸癌的主要方式。同時(shí)聯(lián)合TCT可以有效地提高宮頸癌的準(zhǔn)確率，排除假陰性患者［11］。Rossi等［12］提出陰道鏡下活檢結(jié)果為CIN1或正常的mRNA陽(yáng)性婦女和mRNA陰性的婦女進(jìn)展為CIN2＋的概率分別為每年18．4‰和3．6／‰。

王少蕾等［13］利用bDNA技術(shù)檢測(cè)480例ASCUS以上（含ASCUS）的TCT標(biāo)本進(jìn)行了HPV E6／E7mRNA檢測(cè)顯示，細(xì)胞學(xué)嚴(yán)重程度的增加，E6／E7mRNA的表達(dá)同時(shí)增加，隨著細(xì)胞病理學(xué)病變程度的增高，陽(yáng)性率隨之提高。27例癌的標(biāo)本中，HPV E6／E7mRNA檢測(cè)均為陽(yáng)性，拷貝值較高。Tinelli等［14］的一項(xiàng)隨訪研究發(fā)現(xiàn)，mRNA陽(yáng)性而活檢正常的婦女進(jìn)展為CIN的平均時(shí)間為12個(gè)月。因此，在細(xì)胞學(xué)和HPV DNA檢測(cè)基礎(chǔ)上再行E6／E7mRNA檢測(cè)，根據(jù)E6／E7mRNA結(jié)果對(duì)婦女進(jìn)行分層管理并制定個(gè)性化的篩查間隔時(shí)間可能更為合理，可降低宮頸病變的漏診率，優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)，可避免過度頻繁的檢查給患者帶來的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。

4 HPV E6／E7mRNA在CINII及以上病變中的診斷價(jià)值

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。幾乎100%的高級(jí)別CIN以及宮頸癌都合并HPV感染［15］。目前，用于宮頸癌篩查的主要是細(xì)胞學(xué)聯(lián)合HPV DNA檢測(cè)，兩者的檢測(cè)結(jié)果不能給出病變的明確級(jí)別。研究證實(shí)細(xì)胞學(xué)和HPV DNA檢測(cè)的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值低于HPV E6／E7mRNA檢測(cè)［16］。Benevolo等［17］對(duì)489例細(xì)胞學(xué)異常和 HPV DNA陽(yáng)性的婦女進(jìn)行E6／E7mRNA檢測(cè)和陰道鏡活檢，發(fā)現(xiàn)217例mRNA陽(yáng)性的婦女中有121例活檢結(jié)果為CIN2＋，272例mRNA陰性的婦女中僅53例活檢結(jié)果為CIN2＋。研究證實(shí)：Aptima檢測(cè)技術(shù)對(duì)診斷CIN2＋ （CIN2、CIN3和宮頸癌）的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比第2代雜交捕獲試驗(yàn)（HC2）和液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)更高［18］。黃凌霄等［19］對(duì)426例患者研究發(fā)現(xiàn) HPV E6／E7mRNA預(yù)測(cè)ASCUS患者CINII＋的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為 90．0%、64．2%、54．2%、93．2%。與HR-HPV DNA檢測(cè)相比，其特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均較高，靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值相近。

HPV DNA檢測(cè)現(xiàn)廣泛用于宮頸病變的篩查和隨訪，尤其是在ASCUS患者的分流中有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，HPV E6／E7mRNA水平與組織學(xué)病變程度之間存在正相關(guān)性。因此在宮頸篩查過程中，HPV E6／E7mRNA水平越高，更需警惕宮頸病變甚至是宮頸癌的可能。因此，若將E6／E7mRNA作為宮頸癌的二線篩查方案，可更有效地篩查宮頸癌。

5 HPVE6／E7mRNA在CIN患者術(shù)后隨訪中的應(yīng)用

宮頸錐切術(shù)是治療CIN2＋的主要方法，但CIN病灶不完全清除仍會(huì)導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，CIN經(jīng)宮頸錐切術(shù)后殘留及復(fù)發(fā)率很高，對(duì)于宮頸病變切緣陰性的患者，約25%患者出現(xiàn)殘留或復(fù)發(fā)［20］。因此對(duì)于CIN患者的術(shù)后隨訪尤為重要。目前對(duì)于CIN治療后的隨訪內(nèi)容主要是細(xì)胞學(xué)和HPV DNA檢測(cè)，但兩者對(duì)于預(yù)測(cè)術(shù)后病灶復(fù)發(fā)的敏感度高而特異度低，導(dǎo)致臨床醫(yī)師的過度診斷和過度治療。因此有學(xué)者提出將HPVmRNA檢測(cè)用于CIN術(shù)后隨訪，但對(duì)于其預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的能力仍存在著爭(zhēng)議。Frega等［21］認(rèn)為其敏感度和陰性預(yù)測(cè)值高于HPV DNA檢測(cè)，HPV mRNA用于預(yù)測(cè)宮頸病變復(fù)發(fā)的敏感度為 73．5%，陰性預(yù)測(cè)值為 97．0%，HPV DNA則分別為44．0% 和93．0%；但Zappacosta等［22］的研究證實(shí)：HPVE6／E7mRNA 預(yù)測(cè)CIN術(shù)后復(fù)發(fā)的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高于細(xì)胞學(xué)聯(lián)合HPV DNA檢測(cè)，認(rèn)為HPVmRNA能夠更早且更為有效地預(yù)測(cè)術(shù)后病灶復(fù)發(fā)。李梅等［23］研究證實(shí)TCT、HPVE6／E7mRNA聯(lián)合檢測(cè)，可提高檢測(cè)的敏感性，同時(shí)發(fā)揮E6／E7mRNA檢測(cè)的特異性，避免過度診斷和治療，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及心理負(fù)擔(dān)。

6 結(jié)語(yǔ)

宮頸癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤之一，也是目前惟一可以預(yù)防的婦科惡性腫瘤，通過早期篩查及干預(yù)可以有效地阻止CIN向?qū)m頸癌進(jìn)展。HPV與宮頸癌的關(guān)系密切，HPV癌基因E6和E7在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前已有多個(gè)國(guó)家開始進(jìn)行宮頸HPV E6／E7mRNA大規(guī)模篩查，并積累大量臨床資料。同時(shí)證實(shí)HPV E6／E7mRNA是宮頸細(xì)胞癌變的重要因素，HPV E6／E7mRNA檢測(cè)不僅對(duì)ASCUS患者高級(jí)別病變具有較高的辨別能力，能更好地篩選出高危人群，其對(duì)判斷宮頸HPV感染階段、預(yù)測(cè)宮頸病變進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)以及判斷宮頸病變的嚴(yán)重程度具有重要價(jià)值。雖然，隨著此類技術(shù)的不斷更新，HPV E6／E7mRNA作為新的病毒分子對(duì)病毒癌基因活性的有比較直觀反應(yīng)，大大提高了HPV檢測(cè)的敏感性、特異性、但其臨床應(yīng)用推廣尚需大樣本量的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)以及長(zhǎng)期的隨訪。

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