阿司匹林預(yù)處理對豚鼠內(nèi)耳缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響

許險艷 王慶林 李德水 謝永華 林文東

（泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，泉州362000）

阿司匹林（aspirin，ASA）的神經(jīng)保護作用在缺血性腦血管疾病的治療與預(yù)防中已得到臨床醫(yī)生的廣泛共識。已有的研究結(jié)果表明，ASA對腦缺血再灌注損傷（ischemian-reperfusion injure，IRI）的神經(jīng)保護作用與抗細(xì)胞凋亡有關(guān)［1］，但是ASA是否對內(nèi)耳IRI導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡也有神經(jīng)保護作用尚不明確。本實驗的目的是建立豚鼠內(nèi)耳IRI模型，觀察ASA預(yù)處理對豚鼠內(nèi)耳IRI后細(xì)胞凋亡的影響，研究內(nèi)耳IRI的病理機制，為ASA的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與分組

豚鼠由福建醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，清潔級，許可證號為松聯(lián)2007-001102370，共64只，體重250～300g，雌雄不拘，要求健康、耳廓反應(yīng)靈敏、鼓膜完整。將豚鼠隨機分成正常組、假手術(shù)組、模型組和干預(yù)組，后兩組再各分為3個亞組：IRI 6h組、24h組及48h組，每組8只。

1．2 動物模型的建立

10%水合氯醛（100mg／kg）腹腔注射麻醉，頸前正中切開，分離各層組織，暴露鎖骨下動脈及其分支椎動脈，并分離一側(cè)頸總動脈。灼斷雙側(cè)椎動脈、用微動脈夾夾閉一側(cè)頸總動脈后計時為缺血時間，30min后松開動脈夾，手術(shù)顯微鏡下觀察到血液復(fù)流后計時為再灌注時間。干預(yù)組在缺血前腹腔注射阿司匹林50mg／kg（北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，批號為J20080078，劑量為100mg／片，研碎溶于生理鹽水2ml），每天一次，共7d。假手術(shù)組術(shù)前等量生理鹽水腹腔注射共7d，手術(shù)時切開皮膚分離組織暴露雙側(cè)椎動脈和一側(cè)頸總動脈后，不做任何處理，30min后即斷頭取材。

1．3 耳蝸組織切片檢查

動物麻醉后4%多聚甲醛（北京賽馳科技生物有限公司）行活體心臟灌注，斷頭取出聽泡，打開聽泡暴露耳蝸，置于4%多聚甲醛中4℃固定24h，10%EDTA（100g／L，上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)）脫鈣7～15d，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，平行于耳蝸中軸切片，片厚4μm，進行HE染色，另備切片用于TUNEL細(xì)胞凋亡檢測。

1．4 耳蝸細(xì)胞凋亡檢測（TUNEL法）

石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，滴加蛋白酶K工作液于37℃濕盒中孵育20min，PBS沖洗5min×3次；按 TUNEL試劑盒（Santa Cruz Biotechnology，Inc．）說明書比例將酶溶液加入標(biāo)記液中獲得TUNEL反應(yīng)混合液，滴加到組織片上，37℃濕盒中孵育60min，PBS沖洗5min×3次；滴加轉(zhuǎn)化-POD于樣品上，37℃濕盒中孵育30min，PBS沖洗5min×3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明后中性樹膠封片。）。每批次均設(shè)對照片，用已知陽性片做陽性對照，滴加未混入酶溶液的標(biāo)記液做陰性對照，

1．5 數(shù)據(jù)收集和分析

顯微鏡下每張HE染色切片觀察耳蝸形態(tài)的改變；每只動物取3張TUNEL染色切片，顯微鏡下每張切片隨機取6個視野，Corti器和螺旋神經(jīng)節(jié)各3個，計算每個視野內(nèi)凋亡細(xì)胞的個數(shù)，取其平均值表示該動物該部位凋亡細(xì)胞數(shù)。

實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，運用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件。正常組、假手術(shù)組、模型組之間進行方差分析比較組間差異，正常組與假手術(shù)組和模型組、干預(yù)組與模型組缺血再灌注組同時間段之間進行LSD檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 耳蝸形態(tài)學(xué)檢測

正常組、假手術(shù)組耳蝸HE染色見Corti器完整，血管紋清晰。模型組耳蝸Corti器變形、毛細(xì)胞缺失、倒伏；血管紋變薄，細(xì)胞間有空泡，螺旋韌帶萎縮或脫落，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失，其中以IRI 24h組損傷最嚴(yán)重。干預(yù)組豚鼠耳蝸Corti器、血管紋、毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)亦有同樣改變，但程度較模型組為輕（見圖1）。

2．2 耳蝸細(xì)胞凋亡檢測

光鏡下TUNEL染色陽性細(xì)胞胞核為棕褐色，伴有核的形態(tài)不規(guī)則或固縮。正常組、假手術(shù)組罕見凋亡細(xì)胞，兩組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組耳蝸缺血再灌注各時間點在上述兩個部位陽性細(xì)胞明顯增多，與正常組相比有顯著性意義（P＜0．01）。干預(yù)組較模型組在每個時間點上每個部位陽性細(xì)胞明顯減少，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）（見圖2、表1）。

3 討論

ASA也叫乙酰水楊酸，是一種歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥，有廣譜藥理活性和多個作用位。進入機體后易吸收、在全身組織分布廣、作用強，用于治感冒、發(fā)熱、疼痛、風(fēng)濕病等的治療，另外還能抑制血小板聚集、抗血栓，用于預(yù)防和治療缺血性心臟病、心絞痛、心肺梗塞、腦血栓形成。隨著對IRI研究的深入，發(fā)現(xiàn)ASA對IRI導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡也有很好的抑制作用。

IRI導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機制包括一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，有細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)、自由基的形成、線粒體功能紊亂、興奮性氨基酸的毒性作用、凋亡相關(guān)基因的表達等。ASA能夠抑制大鼠局灶性腦IRI后內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元內(nèi)皮素（endothelin，ET）的表達，ET可通過引起中性粒細(xì)胞聚集、增加氧自由基產(chǎn)生、使興奮性氨基酸釋放增加等機制加重神經(jīng)損傷、導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡［2］。在大腦中動脈IRI后，ASA能減少同側(cè)皮質(zhì) Hsp27、NF-κB和TNF-α的表達而起到減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)和減少細(xì)胞凋亡的作用［3］。ASA還可以通過減少谷氨酸和IL-6的釋放發(fā)揮神經(jīng)保護作用［4］。IRI后腦組織內(nèi)靜止型小膠質(zhì)細(xì)胞被激活轉(zhuǎn)化為活化型小膠質(zhì)細(xì)胞，ASA對小膠質(zhì)細(xì)胞激活有明顯抑制作用，ASA還可能減緩以小膠質(zhì)細(xì)胞為中心的炎癥級聯(lián)反應(yīng)惡性循環(huán)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用［5］。除了神經(jīng)組織以外，ASA對其他臟器和組織細(xì)胞的凋亡也有明顯的抑制作用［6-8］。但是對于腫瘤細(xì)胞，有實驗顯示ASA卻發(fā)揮了促進腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［9］。其機制是ASA可通過激活JAKl／STATl信號通路，上調(diào)促凋亡基因XAFl的轉(zhuǎn)錄，XAFl再通過誘導(dǎo)Bax表達促進細(xì)胞色素C的表達，進而激活caspase-9和caspase-3通過內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。另外ASA還可以下調(diào)腫瘤細(xì)胞抗凋亡基因G1P3的轉(zhuǎn)錄?？紤]細(xì)胞凋亡的過程涉及多種基因的調(diào)控、多種蛋白的表達，需要多種細(xì)胞通路的作用，而腫瘤的發(fā)生是多個基因突變累積的共同結(jié)果，所以使ASA與凋亡的關(guān)系也變得復(fù)雜和多樣。本次實驗結(jié)果顯示，正常組、假手術(shù)組耳蝸罕見凋亡細(xì)胞；模型組Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)在缺血再灌注各個時間點均有細(xì)胞凋亡，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；干預(yù)組螺旋神經(jīng)節(jié)和Corti器的凋亡細(xì)胞在IRI的每個時間點上都較模型組較少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明ASA對IRI的內(nèi)耳有保護作用，這種保護作用是通過抑制細(xì)胞凋亡而實現(xiàn)的。

表1 各組豚鼠耳蝸各部位單視野凋亡細(xì)胞的個數(shù)（x±s，n＝8）

表1 各組豚鼠耳蝸各部位單視野凋亡細(xì)胞的個數(shù)（x±s，n＝8）

注：＊：與正常組比較P＜0．05；☆：與模型組同等時間點比較P＜0．05。

組別 正常組 假手術(shù)組 模型組IRI6h IRI24h IRI48h ASA 預(yù)處理組IRI6h IRI24h IRI48h Corti器 0．10±0．17 0．12±0．13 3．59±0．52＊ 4．95±0．64＊ 4．10±0．36＊ 2．13±0．27＊☆ 2．97±0．53＊☆ 3．05．±0．14＊☆螺旋神經(jīng)節(jié) 0．12±0．08 0．13±0．14 3．81±0．31＊ 5．09±0．25＊ 4．86±0．63＊ 2．49±0．85＊☆ 3．71±0．54＊☆ 3．21±0．26＊☆

圖1 耳蝸的形態(tài)（×100）

圖2 凋亡的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 （×200）

［1］ 李澤東，馬靜萍．阿司匹林預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注后caspase-3和AIF表達的影響［J］．中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2009，16（4）：281-284．

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