家兔小腿屈伸趾肌群肌纖維型增齡變化研究

羅懷香 薛 黔

1（遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育教研室，遵義563099）

2（遵醫(yī)學(xué)院 人體解剖教研室，遵義563099）

人類(lèi)衰老過(guò)程中，肌肉是人體最先衰老的器官之一。自然增齡過(guò)程中，人體會(huì)出現(xiàn)的退行性改變主要表現(xiàn)為肌肉萎縮和力量水平的下降，導(dǎo)致人體肌肉功能結(jié)構(gòu)減少并且增加慢性代謝性疾病發(fā)展的危險(xiǎn)。骨骼肌質(zhì)量下降的現(xiàn)象始于50歲左右，但是更明顯的減少是在60歲以后［1］。對(duì)于衰老過(guò)程中骨骼肌的改變，主要集中表現(xiàn)在肌纖維類(lèi)型、肌纖維數(shù)目和肌纖維橫切面積的變化等方面［2］。本實(shí)驗(yàn)采用NADH-TR＼染色方法對(duì)生后4周齡、12月齡、24月齡和36月齡家兔屈伸趾肌群進(jìn)行研究，觀察自然增齡過(guò)程中肌纖維型的變化，為人類(lèi)老齡化骨骼肌的研究提供比較解剖學(xué)的資料。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

各年齡段家兔共24只，分別是出生后4周、12月、24月、36月齡，雌雄不拘，均購(gòu)自遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)選用的動(dòng)物模型是自然增齡的家兔，按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)計(jì)算好的生理能量，在一定的飼養(yǎng)條件下，讓其自然生長(zhǎng)，一般不通過(guò)藥物干預(yù)的裝置，從而使家兔逐漸達(dá)到該時(shí)間段的實(shí)驗(yàn)要求。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)材料 家兔空氣栓塞處死，取雙側(cè)趾長(zhǎng)伸肌、 長(zhǎng)伸肌、趾淺屈肌和趾深屈肌，剔除肌肉表面筋膜，切取肌肉腹中部（0．5cm×0．2cm）組織塊，錫紙包裹，置入液氮（-196℃）冷凍。

1．2．2 組織切片準(zhǔn)備 液氮內(nèi)取出組織塊，置于橫冷切片箱，在-22℃條件下作冰凍切片，切片厚度為10μm，室溫下干燥30～60min。

1．2．3 組織切片的 NADH-TR酶染色 選用Tris-HCL緩沖液配置孵育液并染色，切片置37℃條件下孵育30～40min，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。1．2．4 NADH-TR染色后，取趾長(zhǎng)伸肌、 長(zhǎng)伸肌、趾淺屈肌和趾深屈肌各年齡段樣本切片，圖像分析系統(tǒng)下每例測(cè)數(shù)10張切片，每張切片隨機(jī)測(cè)數(shù)10個(gè)視野，每個(gè)視野面積為500×500μm2。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17．0軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來(lái)表示，用單因素方差進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。

2 結(jié)果

2．1 染色所見(jiàn)

經(jīng)NADH-TR染色后，顯微鏡下觀察，在4周齡組至36月齡組家兔屈伸趾肌群的切片上，能明顯區(qū)分出三型肌纖維，即Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型。其中，Ⅰ型肌纖維橫切面積最小，染色最深，呈深藍(lán)紫色，胞漿內(nèi)藍(lán)紫色顆粒粗大，分布較均勻；ⅡB型肌纖維橫切面積最大，染色最淺，呈淡藍(lán)色，胞漿內(nèi)的染色顆粒分布均勻；ⅡA型肌纖維染色中等，呈淡藍(lán)紫色，胞漿內(nèi)染色顆粒粗大，肌膜下分布多于中央（見(jiàn)圖1），其中在4周齡組、12月齡組24月齡組肌染色切片上，鏡下可見(jiàn)呈深藍(lán)紫色、淡藍(lán)紫色和淡藍(lán)色的三型肌纖維，即Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型。三型肌纖維呈棋盤(pán)狀鑲嵌分布，肌纖維形態(tài)多呈橢圓形和圓形（見(jiàn)圖1A、B、C）；在36月齡組肌纖維的橫切面多呈三角形，可見(jiàn)小角化肌纖維及10余條同一型肌纖維聚集在一起，以Ⅰ型肌纖維為主（見(jiàn)圖1D）。

圖1 各年齡組家兔趾淺屈肌型增齡變化（NADH-TR染色，×200）

2．2 肌纖維型的構(gòu)成比變化

屈伸趾肌群各實(shí)驗(yàn)組三型肌纖維的構(gòu)成比（見(jiàn)表1，2，3，4）。伸趾肌群中，趾長(zhǎng)伸肌和 長(zhǎng)伸肌Ⅰ型肌纖維構(gòu)成比隨增齡均呈梯度下降，到24月齡降到最低，36月齡時(shí)比例上升，在24月齡組的基礎(chǔ)上，36月齡組Ⅰ型肌纖維分別增加了0．66%、16．07%，長(zhǎng)伸肌增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0．05；ⅡB型肌纖維構(gòu)成比隨增齡均逐漸增加，到24月齡時(shí)增加到最大值，36月齡時(shí)比例下降，在24月齡組的基礎(chǔ)上，36月齡組分別下降了16．94%、33．50%，而ⅡA型則分別增加了25．86%、25．98%，伸趾肌群ⅡA型和ⅡB型變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0．05。屈趾肌群中，趾淺屈趾和趾深屈肌4周齡組至24月齡組Ⅰ型肌纖維構(gòu)成比隨增齡呈梯度下降，到24月齡降到最低，在36月齡時(shí)比例上升。ⅡB型肌纖維構(gòu)成比的變化恰好相反。在24月齡組的基礎(chǔ)上，36月齡組Ⅰ型肌纖維分別增加了1．17%、18．39%，ⅡB型分別下降了0．47%、17．27%，趾淺屈肌ⅡA型下降了0．43%，趾深屈肌增加了15．70%，其中趾深屈肌三型肌纖維變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0．05。

表1 生后發(fā)育和增齡過(guò)程中家兔趾趾長(zhǎng)伸肌纖維構(gòu)成比（n＝6，±s，%）

表1 生后發(fā)育和增齡過(guò)程中家兔趾趾長(zhǎng)伸肌纖維構(gòu)成比（n＝6，±s，%）

注：★與24月齡組比較P＜0．05

年齡 趾長(zhǎng)伸?、裥停?） ⅡA型（%） ⅡB型（%）4周 47．83±3．74★ 23．74±3．45 28．43±1．63★12月 31．52±0．35 32．58±1．45★ 35．90±1．71★24月 29．97±1．37 22．50±1．51 47．53±1．72 36月 30．17±1．66 30．35±2．38★ 39．48±2．53★

表2 生后發(fā)育和增齡過(guò)程中家兔 長(zhǎng)伸肌纖維構(gòu)成比（n＝6，±s，%）

表2 生后發(fā)育和增齡過(guò)程中家兔 長(zhǎng)伸肌纖維構(gòu)成比（n＝6，±s，%）

注：★與24月齡組比較P＜0．05

年齡 長(zhǎng)伸肌Ⅰ型（%） ⅡA型（%） ⅡB型（%）4周 47．70±3．26★ 25．28±3．19★ 27．02±2．04★12月 27．17±0．31★ 29．46±0．59 43．37±0．65 24月 21．68±1．22 32．20±2．84 46．12±4．13 36月 25．83±2．39★ 43．50±2．05★ 30．67±1．55★

表3 生后發(fā)育和增齡過(guò)程中家兔趾淺屈肌纖維構(gòu)成比（n＝6，±s，%）

表3 生后發(fā)育和增齡過(guò)程中家兔趾淺屈肌纖維構(gòu)成比（n＝6，±s，%）

注：★與24月齡組比較P＜0．05

年齡 趾淺屈?、裥停?） ⅡA型（%） ⅡB型（%）4周 46．25±0．38★ 27．42±1．24★ 26．33±1．09★12月 26．18±2．19 26．52±1．90★ 47．30±1．33★24月 27．97±1．49 21．11±1．37 50．92±1．50 36月28．30±0．83 21．02±1．17 50．68±1．82

3 討論

生后發(fā)育早期（前幾周）是哺乳動(dòng)物骨骼肌肌纖維生長(zhǎng)和分化的主要階段［3］。在生后發(fā)育過(guò)程中，同一動(dòng)物不同肌肉各型肌纖維分化發(fā)育規(guī)律不同［4］。本研究通過(guò)NADH-TR染色發(fā)現(xiàn)：生后4周齡時(shí)，可清晰觀察到Ⅰ型及Ⅱ型纖維的亞型纖維，即ⅡA和ⅡB型。三型肌纖維中，Ⅰ型比例最大。家兔屈伸趾肌群肌纖維自4周至24月齡組Ⅰ型纖維均逐漸減少，至24月齡組時(shí)下降到最低。ⅡA型在各個(gè)年齡段變化幅度小。ⅡB型纖維構(gòu)成比的變化與Ⅰ型纖維恰好相反，即4周至24月比例逐漸增加，至24月齡時(shí)達(dá)到最高，與朱道立等人研究結(jié)果一致［5］。

表4 生后發(fā)育和增齡過(guò)程中家兔趾深屈肌纖維構(gòu)成比（n＝6x±s，%）

Aniansson等［6］對(duì)老年男性的股外側(cè)肌和肱二頭肌的縱向研究表明：與青年組相比，股外側(cè)肌和肱二頭肌的ⅡB型肌纖維的比例都下降了50%。Lexell等［7］，與年輕人相比，在老年人的股外側(cè)肌中，肌纖維數(shù)量下降40%，Ⅱ型肌纖維減少25%～30%。Caccia通過(guò)研究比較3月齡和36月齡的大鼠趾長(zhǎng)伸肌和比目魚(yú)肌得出，比目魚(yú)肌從3～4月齡到30月齡，Ⅰ型肌纖維比例從73．5%減少到40．5%，ⅡA型肌纖維比例增加，而趾長(zhǎng)伸?、裥图±w維的百分比是增加的，ⅡA和ⅡB型是減少的［8］。本研究得出，36月齡老年組家兔與12月齡青年組相比，趾長(zhǎng)伸肌和趾淺屈肌ⅡA型肌纖維分別下降了6．84%、20．59%， 長(zhǎng)伸肌和趾深屈?、駼型肌纖維分別下降29．28%、12．15%。與24月齡組相比，36月齡組屈伸趾肌群Ⅰ型肌纖維比例均有增加，分別為趾長(zhǎng)伸肌0．66%、 長(zhǎng)伸肌16．07%、趾淺屈肌1．17%、趾深屈肌18．39%；ⅡB型肌纖維呈下降趨勢(shì)，下降比例分別為：趾長(zhǎng)伸肌16．94%， 長(zhǎng)伸肌33．50%，趾淺屈肌0．47%，趾深屈肌17．27%。與以上研究結(jié)果一致，隨著增齡改變，Ⅰ型肌纖維比例增加，Ⅱ型肌纖維比例下降。

據(jù)肌纖維型研究結(jié)果顯示，在青年人的肌肉，不同類(lèi)型肌纖維呈馬賽克狀分布，在老年人，表現(xiàn)為相同類(lèi)型的肌纖維型聚集在一起，即肌纖維類(lèi)聚（“Fiber-type grouping”）［7］。Kung等［9］使用 ATP酶染色分別對(duì)成年組大鼠（11～13月齡）和老年組大鼠（36～37月齡）的趾長(zhǎng)伸肌進(jìn)行肌纖維型的觀察，染色表明，成年組大鼠三型肌纖維鑲嵌分布呈棋盤(pán)狀，老年組則觀察到3～4個(gè)Ⅰ型肌纖維呈肌纖維類(lèi)聚。Andersen等［10］分別對(duì)22歲和87歲兩個(gè)年齡組肌肉使用ATP酶染色得出，22歲年齡組肌纖維呈現(xiàn)棋盤(pán)狀分布，而87歲年齡組肌纖維明顯出現(xiàn)了肌纖維類(lèi)聚現(xiàn)象。這種隨著年齡增加肌纖維型組成改變的現(xiàn)象是失神經(jīng)和神經(jīng)再支配的過(guò)程［11］。本實(shí)驗(yàn)4周至24月齡組軍觀察到三型肌纖維呈棋盤(pán)狀分布，36月齡組老年家兔屈伸趾肌群均可見(jiàn)10余條肌纖維聚集在一起，且Ⅰ型纖維較明顯，我們推測(cè)Ⅱ型肌纖維運(yùn)動(dòng)單位開(kāi)始向Ⅰ型肌纖維轉(zhuǎn)換。骨骼肌肌纖維萎縮的組織學(xué)表現(xiàn)為：肌纖維小角化、圓形化、肌纖維直徑的差別增大等［12］。Andersen使用ATP酶染色觀察到的老年人肌纖維形態(tài)多樣，多呈扁平或者“煎薄餅”、“香蕉”狀肌纖維［10］，黃麗敏等［13］使用Gomori染色研究得出，老年組（17月齡）和高齡老年組（30月齡）大鼠腓腸肌肌纖維開(kāi)始萎縮甚至壞死，多呈現(xiàn)小角化纖維。本實(shí)驗(yàn)中36月齡組各型肌纖維的大小和形態(tài)出現(xiàn)多樣性改變，多呈三角形或不規(guī)則形，還可觀察到小角化肌纖維，可能是肌細(xì)胞凋亡的早期跡象，但仍需用高齡動(dòng)物肌研究進(jìn)行進(jìn)一步觀察和驗(yàn)證。

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