阿司匹林對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞腫瘤干性標(biāo)記物CD44蛋白表達(dá)的影響

魯生念，廖永美，趙逵

（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563099）

阿司匹林對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞腫瘤干性標(biāo)記物CD44蛋白表達(dá)的影響

魯生念，廖永美，趙逵

（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563099）

目的研究人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW-480、HT-29中腫瘤干細(xì)胞干性標(biāo)記物CD44蛋白受阿司匹林不同藥物濃度的影響變化，從而探討阿司匹林是如何預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生。方法采用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)：免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW-480、HT-29中CD44的表達(dá)；用Western blotting檢測(cè)不同濃度阿司匹林（0、2.5、5.0、10.0 mmol/L，即分別為空白對(duì)照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組）作用下，CD44在COX-2陰性表達(dá)的SW-480細(xì)胞及COX-2高表達(dá)的HT-29細(xì)胞表達(dá)影響。結(jié)果SW-480、HT-29中存在CD44陽(yáng)性細(xì)胞，2種細(xì)胞表達(dá)的CD44熒光值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Western blotting結(jié)果顯示阿司匹林能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系SW-480、HT-29中CD44的表達(dá)，且具有明顯的量-效關(guān)系（P<0.05），2種細(xì)胞組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論結(jié)腸癌細(xì)胞系SW-480、HT-29中存在CD44陽(yáng)性細(xì)胞，阿司匹林能抑制腫瘤干細(xì)胞干性標(biāo)記物CD44的表達(dá)，其抑制可能是通過(guò)COX-2及非COX-2途徑，該抑制作用可能是阿司匹林能預(yù)防結(jié)腸癌的原因之一。

阿司匹林；結(jié)腸腫瘤；腫瘤干細(xì)胞；CD44蛋白

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在西方發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)居于惡性腫瘤第3位[1]。我國(guó)近年來(lái)由于環(huán)境、飲食及生活習(xí)慣等因素的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率以及患者死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，如何有效地進(jìn)行預(yù)防及改進(jìn)治療方法成為目前亟待解決的問(wèn)題。直至腫瘤干細(xì)胞（CSCs）概念[2-3]的提出為腫瘤研究提供了新的方向及思路，是目前放療、化療及生物免疫治療等方法能夠殺滅部分腫瘤細(xì)胞的“靶標(biāo)”，使更有效地治療惡性腫瘤成為可能。

CD44是一種由單基因編碼，具有一個(gè)高度保守的N末端的一種跨膜糖蛋白，其基因位于11p13。有研究認(rèn)為，CD44具有GTP酶活性的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸連接蛋白，具有獨(dú)特的信號(hào)傳遞通路，是一種重要的細(xì)胞黏附因子。CD44分布廣泛，它對(duì)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后都至關(guān)重要[4]。阿司匹林作為一種臨床常用的非甾體抗炎藥（NSAIDs），除常用于解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等外，常用于預(yù)防某些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如每天服用該類藥物能降低結(jié)直腸腺瘤及癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，能抑制甚至逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌的癌前病變[5-6]，有效地改善患者預(yù)后。有大量研究認(rèn)為，阿司匹林是通過(guò)依賴COX-2途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，但針對(duì)某些腫瘤并未表達(dá)COX-2，NSAIDs仍能抑制腫瘤的發(fā)生。阿司匹林是如何作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞，對(duì)CSCs干性標(biāo)志物CD44產(chǎn)生的影響尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究不同濃度阿司匹林對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW-480、HT-29中CD44蛋白表達(dá)的影響以探討其對(duì)結(jié)直腸癌的潛在影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-480、HT-29分別購(gòu)買于重慶醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室及中國(guó)科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 藥物和主要試劑阿司匹林、胰蛋白酶及乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，小鼠抗人CD44單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signling Technology公司，小鼠抗人β-actin辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG及辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)用含10%胎牛血清及1%雙抗的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-480、HT-29，孵箱的條件設(shè)置為37℃、5%CO2，培養(yǎng)瓶為25 cm2，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好并融合至80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA混合液消化、離心（1000 r/min，5 min），進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)優(yōu)良的細(xì)胞收集用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)SW-480和HT-29細(xì)胞中CD44的表達(dá)將高壓后的無(wú)菌蓋玻片置于6孔板中，進(jìn)行細(xì)胞種板，種板時(shí)調(diào)整每孔細(xì)胞密度為0.8×105mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，貼壁后4%多聚甲醛進(jìn)行固定，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，用0.5%Triton-X-100的PBS通透化15 min，1%牛血清蛋白（BSA）封閉；加入按抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行1∶400稀釋的鼠抗人CD44單克隆抗體，室溫避光孵育1 h后4℃過(guò)夜，棄去抗體稀釋液后，PBS反復(fù)漂洗，加四乙基若丹明異硫氰酸鹽（TRITC）標(biāo)記的1∶100稀釋的二抗，避光孵育1 h，漂洗后撈片、風(fēng)干、封固，同時(shí)PBS代替一抗用于陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片，采圖時(shí)每張細(xì)胞玻片上選取3個(gè)比較具有代表性的區(qū)域，按照標(biāo)準(zhǔn)選擇參數(shù)拍照。

1.2.3 Western blotting法檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW-480、HT-29細(xì)胞中CD44蛋白的表達(dá)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2種細(xì)胞分別進(jìn)行消化離心，吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，調(diào)整密度為5×105mL-1后于25 cm2的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。配置含有阿司匹林的完全培養(yǎng)基，空白對(duì)照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組藥物濃度分別為0、2.5、5.0、10.0 mmol/L。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后分別加入上述不同組別的培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。裂解液（RIPA）提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，定濃度為80 μg/μL，10%的聚丙烯酰胺凝膠上量20 μL（每孔約30 μg）進(jìn)行電泳，恒壓轉(zhuǎn)膜（40 mV，4 h）后，予5%脫脂蛋白封閉1h，0.1%洗膜緩沖液（TBST）洗3次后加入1∶1 000稀釋的小鼠抗人CD44單克隆抗體以及1∶5 000稀釋的小鼠抗人β-actin一抗，搖床上4℃過(guò)夜，TBST漂洗，加入1∶5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG室溫下孵育1 h，TBST再次漂洗，應(yīng)用魯米諾熒光顯色，暗室內(nèi)膠片曝光，根據(jù)膠片上顯影效果，調(diào)整曝光時(shí)間直至出現(xiàn)最佳條帶，電腦掃描，結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果

2.1.1 免疫熒光分析CD44在結(jié)腸癌細(xì)胞系SW-480、HT-29細(xì)胞中的表達(dá)見(jiàn)圖1。

圖1 免疫熒光法分析CD44在SW-280、HT-29中的表達(dá)（×200）

2.1.2 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)CD44在SW-480、HT-29細(xì)胞中表達(dá)的熒光值分別104.110±3.123、83.771±3.999，其在這2種結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 結(jié)腸癌細(xì)胞系SW-480、HT-29細(xì)胞中CD44熒光值比較

2.2 Western blotting法分析不同組別阿司匹林對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW-480、HT-29細(xì)胞中CD44蛋白表達(dá)的影響Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示，在SW-480、HT-29細(xì)胞中，由空白對(duì)照組-低濃度-高濃度阿司匹林組，CD44蛋白印記條帶顏色均是由深至淺（圖3）。SW-480細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中CD44蛋白的校準(zhǔn)值（CD44蛋白的積分光密度值/β-actin蛋白的積分光密度值）分別為1.31850±0.12497、0.987 80±0.143 99、0.738 00±0.134 07，相比較于空白對(duì)照組1.618 0±0.1331 2均較低。HT-29細(xì)胞中實(shí)驗(yàn)組中CD44蛋白的校準(zhǔn)值（CD44/β-actin）分別為1.238 50± 0.117 04、1.121 80±0.155 28、0.793 20±0.124 95，相較于空白對(duì)照組1.552 3±0.148 37均較低。對(duì)照組與不同實(shí)驗(yàn)組結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但是SW-480、HT-29細(xì)胞組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3、4。

圖3 Westem blotting檢測(cè)SW-480、HT-29細(xì)胞中不同藥物濃度時(shí)CD44蛋白的表達(dá)

圖4 SW-480、HT-29細(xì)胞中不同組別CD44蛋白的表達(dá)（CD44/β-actin校準(zhǔn)值）的比較

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)異常復(fù)雜的過(guò)程，涉及多基因、多階段、多因素的影響，腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，CSCs是腫瘤的“起始細(xì)胞”或“動(dòng)力細(xì)胞”，是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及反復(fù)復(fù)發(fā)的源泉，起著關(guān)鍵作用。目前研究認(rèn)為，結(jié)腸癌干細(xì)胞可能起源于正常結(jié)腸隱窩干細(xì)胞，當(dāng)此類細(xì)胞出現(xiàn)功能紊亂，例如自我更新、分化、克隆增殖和凋亡失去平衡[7]，可能直接或間接導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生，這類細(xì)胞很有可能就是腫瘤干細(xì)胞的最早起源。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中含量極少的具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，能持續(xù)自我更新及不斷分化出有不同增殖能力的細(xì)胞[8]，這可能是腫瘤不斷侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，傳統(tǒng)抗腫瘤治療無(wú)效及放化療產(chǎn)生耐受的根本原因。CD44通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，在腫瘤細(xì)胞黏附、新生血管形成和腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[9]，Blacking等[10]在動(dòng)物細(xì)胞中的研究顯示，細(xì)胞周期中所處的位置與CD44的表達(dá)水平與增殖能力緊密相連。目前已有多項(xiàng)研究表明CD44與結(jié)直腸癌、胃癌、皮膚癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸腺瘤向結(jié)腸癌的發(fā)展過(guò)程中，在K-ras基因突變相關(guān)影響下，CD44基因的表達(dá)會(huì)逐漸上調(diào)，甚至比P53等基因的變化還早，證實(shí)CD44可作為結(jié)直腸腫瘤發(fā)生早期檢測(cè)的重要分子標(biāo)志物之一。CD44在正常腸黏膜中幾乎呈陰性表達(dá)，但在結(jié)直腸癌或伴不典型增生的腺瘤組織中，其呈局灶狀分布于腺管周圍，并且在癌組織中的表達(dá)與腺瘤組織中的表達(dá)均有顯著性差異。研究發(fā)現(xiàn)，CD44從增生性息肉到腺瘤性息肉表達(dá)逐漸上調(diào)，尤其在腺瘤性息肉和腺癌組織中表達(dá)明顯，提示其從正常腸黏膜到腺瘤直至發(fā)展到癌的轉(zhuǎn)變過(guò)程中可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用[10]，并且研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)及Dukes分期都與CD44的表達(dá)密切相關(guān)[12]。有研究發(fā)現(xiàn)CD44陽(yáng)性的結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，而CD44陰性者并不具備動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力。多項(xiàng)研究已發(fā)現(xiàn)CD44分子參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HT-29及SW-480中都明確存在CD44陽(yáng)性細(xì)胞，CD44作為結(jié)直腸癌的腫瘤相關(guān)干性標(biāo)記物，可能成為結(jié)直腸癌治療的新靶點(diǎn)。

已有大量研究證實(shí)，每天按規(guī)定服用阿司匹林或其他非甾體類抗炎藥物可有效地預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生，降低患癌危險(xiǎn)性及癌癥病死率，也能降低術(shù)后復(fù)發(fā)率、改善患者生活質(zhì)量、提高5年生存率等[13]。研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林的作用與腫瘤的病理類型、臨床分期甚至患者服用藥物的時(shí)間相關(guān)，與腫瘤COX-2表達(dá)水平也有所關(guān)聯(lián)。Cardwell等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，明確診斷患結(jié)直腸癌后每天服用阿司匹林能夠改善患者的預(yù)后，提高患者生存率，特別是針對(duì)COX-2過(guò)度表達(dá)的原發(fā)性腫瘤患者，但是診斷前服用與預(yù)后改善卻無(wú)明顯相關(guān)性。所以NSAIDs是如何預(yù)防、治療癌癥的機(jī)制目前尚不十分清楚，CD44作為結(jié)腸癌的干性標(biāo)記物，與阿司匹林預(yù)防結(jié)腸癌的作用是否相關(guān)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480和HT-29細(xì)胞中，CD44蛋白的表達(dá)隨著阿司匹林藥物濃度的不斷增加呈明顯逐級(jí)下降趨勢(shì)，并具有明顯的藥物濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這表明阿司匹林預(yù)防結(jié)直腸癌的作用可能是通過(guò)抑制CD44蛋白的表達(dá)從而抑制細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的分化及增殖。因癌組織中COX-2的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)可顯著升高，故普遍認(rèn)為阿司匹林的預(yù)防作用是因?yàn)镹SAIDs能夠抑制環(huán)氧化酶（COXs）的合成，從而減少花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，在極大部分的結(jié)直腸癌及癌前病變組織中可檢測(cè)到COX-2的高表達(dá)，所以大部分研究認(rèn)為NSAIDs是通過(guò)抑制COX-2表達(dá)，從而阻斷癌細(xì)胞的分化增殖、遷移，但選擇性COX-2抑制劑能夠阻礙Wnt/ β-catenin信號(hào)通路是通過(guò)誘導(dǎo)TCFs降解的原因，但卻不依賴COX-2途徑[15]。本實(shí)驗(yàn)中CD44的表達(dá)在SW-480（COX-2陰性表達(dá)）及HT-29（COX-2高表達(dá)）2種細(xì)胞組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明阿司匹林抗大腸腫瘤的機(jī)制并非僅僅涉及COX-2途徑，可能也與非COX-2途徑密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對(duì)COX-2高表達(dá)的結(jié)腸腺瘤患者無(wú)明顯作用，卻可降低低表達(dá)COX-2患者的復(fù)發(fā)率。NSAIDs可以抑制陰性表達(dá)COX-2的腫瘤細(xì)胞系SW-480、HCT116細(xì)胞的增殖，Nath等[16]證實(shí)，NSAIDs可以阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而抑制非雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞的增殖；另外，阿司匹林可抑制胚胎纖維原細(xì)胞的生長(zhǎng)，而該細(xì)胞并不表達(dá)COX-2基因。在不同藥物濃度的阿司匹林影響后，在COX-2陰性和陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞中都能檢測(cè)到腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD44的降低，且均有量效關(guān)系。所以研究認(rèn)為非甾體類抗炎藥物是通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)結(jié)直腸癌產(chǎn)生的預(yù)防治療作用，其中非COXs依賴途徑是主要的通路之一，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)可能是通過(guò)抑制CD44腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，從而達(dá)到預(yù)防甚至治療結(jié)直腸癌的作用。但關(guān)于阿司匹林預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展與CD44相關(guān)通路的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

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Treatment with aspirin inhibiting the expression of tumor stem marker CD44 in human colorectal cancer cells

Lu Shengnian，Liao Yongmei，Zhao Kui
（Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563099，China）

Objective To investigate the effects of aspirin affected by changes in the concentration of different drugs on CD44，which was supposed to be the marker of tumor stem cells in colon cancer cell line SW-480 and HT-29 so as to explore how to prevent the occurrence of colorectal cancer with aspirin.Methods The expression of CD44 in the colon cancer cell line SW-480 and HT-29 cells was observed by laser scanning confocal microscopy and immunofluorescence double staining.The expression of CD44 protein in human colon cancer SW480（negative expression of COX-2）and HT-29（high expression of COX-2）cells with aspirin at different concentrations（0，2.5，5.0，10.0 mmol/L，namely the control group，the low-concentration group，the middleconcentration group and the high-concentration group）were detected by Western blotting.Results CD44+cells existed the SW-480 and HT-29 cells.There were statistical significance fluorescence value expressed by two kinds of cells.The difference had statistical significance（P<0.05）.Asprin could inhibit the expression of colon cancer cell line SW-480 and HT-29 by Western blotting，which showed an obvious dose-effect relationship（P<0.05）.There were no statistical significance in difference between the two kinds of cells（P＞0.05）.Conclusion CD44+cells exist in the SW-480 and HT-29 cells.Aspirin may inhibit the expression of CD44 protein，the tumor stem maker in the colon cancer cell line SW-480 and HT-29，which was supposed to be acted by COX-2 and non COX-2 pathways.Asprin is probably one of factors to prevent colorectal cancer.

Aspirin；Colonic neoplasms；Neoplastic stem cells；CD44 protein

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.03.002

A

1009-5519（2015）03-0323-03

2014-11-02）

貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（TZJF-2011-32）。

魯生念（1988-），女，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事消化系統(tǒng)課題的研究；E-mail：780583556@qq.com。

趙逵（E-mail：kuizhao95868@MSN.com）。