一種新的大鼠脊髓半離斷損傷模型*

齊 超李夏青張 宏

一種新的大鼠脊髓半離斷損傷模型*

齊 超①李夏青①張 宏①

目的：探討一種對機體影響較小、復制性良好的大鼠脊髓損傷模型，為后期藥物及干細胞干預脊髓損傷后修復提供條件。方法：采用改良注射針頭連接注射器作為損傷工具，在不打開脊髓腔的前提下沿脊椎棘突左側垂直插入脊髓，造成大鼠腰髓一側離斷性損傷。除觀察動物的一半行為學改變外，并對脊髓損傷后對大鼠的感覺功能（熱痛反應）、運動功能（抓力測試）變化進行定時觀測，以確定模型復制成功。結果：大鼠麻醉蘇醒后即刻出現一側后肢癱瘓、拖地行走，但無排尿及排便失禁，動物一般狀態(tài)良好，后期未見合并感染，表明動物模型復制成功。結論：用自制的注射器針頭造成的脊髓損傷模型操作簡便、損傷較小、重復好，并且因與其折射相連，可在造模同時局部給予藥物或試劑進行干預，為探索脊髓損傷再生困難的分子機制提供了實驗基礎。

SD大鼠； 脊髓損傷； 脊髓半離斷術

脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）是指由于各種嚴重創(chuàng)傷直接或間接導致的脊髓損傷[1]。根據損傷的部位及受累神經不同，其臨床表現不完全相同，多數患者出現脊髓損傷相應節(jié)段以下的各種運動、感覺和括約肌難以恢復的功能障礙。通常脊髓損傷的程度和臨床表現取決于原發(fā)性損傷的部位和性質，大多數患者伴有程度不等的肢體癱瘓，因此SCI是一種致殘率很高的臨床病癥。由于其本身的解剖結構特征，脊髓損傷后很難再生修復，因此，尋找能夠刺激損傷脊髓神經組織再生修復的新藥制劑及其探索脊髓損傷難以再生的分子機制是臨床及科研領域的重要任務之一。隨著社會各行業(yè)的快速發(fā)展，脊髓損傷的發(fā)病率也隨之增加。因此，對脊髓損傷的研究與關注仍是目前的熱點課題[2]。

脊髓損傷的動物模型是進行脊髓損傷與修復研究的必要基礎，根據相關文獻報道，脊髓損傷的模型有很多種，譬如：（1）挫傷性SCI（重力墮落性）；（2）切割或吸除型SCI；（3）脊髓壓迫性SCI模型；（4）光化學誘導性SCI模型；（5）牽拉性SCI模型等。然而，目前大多數SCI模型均存在有很多弊端。因此本實驗旨在設計一種新型的大鼠脊髓損傷的模型，使其具有較高的穩(wěn)定性和可復制性，成為今后探討某些制劑對脊髓損傷的長期影響的動物模型[3]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取健康SD大鼠6只，體重180～200 g，正常飼料飼養(yǎng)，動物使用及操作按照本校相關規(guī)則執(zhí)行。

1.2 實驗器械 手術刀片、持針鉗、蚊氏鉗、血管鉗、手術鑷、組織剪、縫針。

1.3 方法

1.3.1 SCI模型自制改良1 mL注射器針頭制備方法模型制作過程需要兩個注射器針頭，首先將其中一個注射器的針頭在石板上磨平并消毒，見圖1a；將另一個注射器針頭用持針器向著針頭斜面背側彎曲90°，被彎曲的針頭長度為0.3 cm，見圖1b。

圖1 自制1 mL注射器針頭

1.3.2 SCI模型制備 （1）麻醉：采用無菌1％戊巴比妥鈉注射液腹腔注射，0.4 mL/100 g BW。（2）大鼠采用俯臥位放置手術平臺上，剃去背部毛發(fā)，并用碘酊消毒皮膚。（3）確定T10～T12位置：SD大鼠腰段脊椎棘突突出且斜向尾端，而胸段棘突則略呈直角狀向背側突出，因此，L1與T13棘突間有一個較大的裂隙，以此來判斷T9～T12的位置[4]。確定好位置后沿脊柱正中線、T9～T12部位切開背部皮膚，約2～3 cm，分離脊柱表面的肌肉和筋膜，暴露T9～T12棘突和椎板。隨后，用組織剪和蚊氏鉗將T9～T10棘突左側的肌肉和韌帶剝離徹底暴露T9～T10的棘突和橫突，確定T9～T10間隙。（4）將磨平的1 mL注射器針頭（圖1a）從T10和T9間隙、緊靠棘突左側垂直插入脊髓腔并進入脊髓，同時垂直上下抽插針頭，感覺有較大的活動空間，表明針頭在脊髓腔內，然后拔出針頭。由于脊髓腔內為負壓，椎間隙為軟組織，因此進針時不需太用力，針頭很容易進入脊髓腔及脊髓。當針頭進入脊髓后，大鼠會劇烈抖動。隨后，將彎曲的針頭（圖1b）從進針點垂直插入，進針時彎曲的針尖朝向左側。待針頭進入脊髓腔后一直插入脊髓腔腹側壁，然后向脊髓左側小幅擺動針頭3～4次，此時應絕對避免彎曲的針頭超過棘突中線進入右半側脊髓，由此只破壞左側脊髓。進行此項操作時，左側（損傷側）后肢出現抽搐，拔出針頭前再進行3～4次垂直抽插，以保證左側相應斷脊髓嚴重離斷性損傷。最后輕緩地以垂直角度拔出針頭，此時脊髓半離斷模型建立步驟基本完成，見圖2。（5）手術完畢后縫合肌肉及皮膚，碘酊清潔局部并將大鼠置于干燥，清潔籠內，大鼠清醒后在安靜，自然光條件下普通飼料喂養(yǎng)，并定期用碘酊清潔消毒創(chuàng)口。

圖2 脊髓T9～10進針部位示意圖

1.3.3 觀察內容 （1）動物一般行為觀察：術后1 h，動物清醒后單獨放置于飼養(yǎng)籠內，容許自由活動，觀察大鼠的日常行為活動，如飲水、進食、活動能力、行走姿態(tài)和狀態(tài)以排泄情況等。（2）感覺、運動功能測定：于術后24 h，1、2、3、4周分別對模型大鼠左側（損傷側）及右側（健側）后肢的感覺和運動功能進行檢測。感覺功能檢測采用熱痛敏感儀進行測定，熱痛反應時間用秒（s）表示，操作方法：將大鼠置于底面為玻璃面（可傳導熱）的方盒內，待其處于安靜狀態(tài)后用發(fā)熱光源照射大鼠的后足底，這時開始計時，直至其感到熱痛后抬足終止計時。運動功能測定采用嚙齒類動物抓力儀，抓力大小用克（g）表示，操作方法：大鼠抓持時應輕拿輕放，避免將其激怒，左手將大鼠上半身抓住按放在抓力板上，右手拉住鼠尾，抓力板隨右手拉鼠尾的力量向前滑行，待動物用力抓住抓力板時應及時加力后拉，使其測到動物的最大抓力。（3）脊髓一般形態(tài)學檢查及損傷部位確定：模型大鼠飼養(yǎng)4周后，采用4％的多聚甲醛灌注固定，沿背部脊柱中線自上而下切開皮膚，減去脊柱周圍的筋膜與肌肉，充分暴露脊椎，用蚊氏鉗自脊椎尾端逐級打開整個椎板，暴露髓腔和脊髓，觀察損傷所在部位及傷勢，同時取損傷脊髓段（包括損傷部位頭尾各0.5 cm）進行冰凍切片及HE染色，觀察組織形態(tài)變化[5]。

1.4 統(tǒng)計學處理 實驗中采集數據應用SPSS統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般觀察指標及感覺運動功能測定 正常大鼠四腳觸地，可直立。清醒后的脊髓半離斷術模型大鼠術后3～5 d手術切口處紅腫，數日后恢復正常。與正常大鼠進行對比，模型動物左側后肢癱瘓、拖地行走，且不能直立（圖3）。但大鼠可進行正常日常活動，飲食及排泄均正常，術后并發(fā)癥少，且存活時間較長，截止實驗結束時大鼠一般狀態(tài)良好，對側肢體活動正常。

圖3 模型大鼠術后左右側肢體行走狀態(tài)注：a：大鼠行走時左后肢運動功能喪失；b：大鼠側臥時顯示左后肢運動障礙

2.2 后肢熱痛實驗 模型復制前大鼠兩側后肢熱痛實驗皆為陽性，脊髓損傷后，不同時間點的熱感刺激顯示，大鼠左側與右側后肢術后對熱敏感的刺激反應明顯不同，損傷側動物行熱刺激時，抬腿消失，熱敏實驗陰性。而健側后肢對熱痛反應消失后漸漸恢復，兩側相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 脊髓損傷后不同時間段6只大鼠后肢熱痛反應時間比較（±s） s

表1 脊髓損傷后不同時間段6只大鼠后肢熱痛反應時間比較（±s） s

部位術前術后24 h術后1周術后2周術后3周術后4周左后肢9.56±1.82-----右后肢9.10±1.31-17.83±2.1517.12±1.1416.23±1.8215.89±1.38

術后不同時間點大鼠抓力實驗于20：00進行檢測。模型大鼠左側后肢在不同時間（術后24 h，1周，2周，3周，4周）的抓力明顯小于健側后肢（P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學意義），而且隨著模型復制時間的延長，抓力并無明顯改變，見表2。

表2 脊髓損傷后不同時間段6只大鼠后肢抓力比較（±s） g

表2 脊髓損傷后不同時間段6只大鼠后肢抓力比較（±s） g

*與右后肢比較，P＜0.01

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通過對脊髓半離斷術后的大鼠進行抓力和熱痛反應試驗可看出，手術前大鼠的雙后肢的感覺和運動能力均正常。手術后，隨著時間的推移，患側后肢的運動感覺和反射功能均無恢復，同時，健側后肢運動能力不受影響，對熱痛覺沒有反應，但隨著時間的推移，熱痛反應可以漸漸恢復。因此，本模型的脊髓損傷是成功的，且為單側離斷性脊髓損傷，對大鼠造成感覺和運動功能障礙；同時，根據脊髓形態(tài)定位，T9～T10棘突間隙插入針頭造成的損傷為腰髓部位的損傷，但該模型不伴有明顯的排泄障礙。

2.3 脊髓組織損傷定位及一般形態(tài)學觀察 肉眼觀察：術后24 h大鼠傷口處腫脹，1周后傷口愈合，4周時背部皮膚基本恢復正常。打開脊椎椎板后可見針頭插入部位位于腰髓段，此處脊髓仍充血腫脹，脊髓組織軟化崩解。顯微鏡下觀察（HE染色）：術后大鼠脊髓的損傷區(qū)可見縱行脊髓纖維斷裂，損傷區(qū)域內神經結構基本消失，髓鞘不可辨認，見圖4。

圖4 大鼠損傷段脊髓縱切面HE染色注：a：脊髓縱切面×4HE染色；b：脊髓縱切面×10HE染色

3 討論

隨著轉化醫(yī)學理念的引入，各種用于科學研究的動物疾病模型應更符合臨床實際，并能根據實驗需要進行藥物治療、行為干預及長期療效觀察。因此，作為理想化的脊髓損傷模型應具備以下幾個條件：第一是能反應實驗動物脊髓損傷的神經生理、運動行為的情況；第二是可以提供與臨床脊髓損傷一致或相似的動物模型，即具有良好的臨床相關性：第三是模型要具有可復制性。研究脊髓損傷需大量的實驗動物，這就需要制造模型的標準化[6]。以往文獻報道的常用的動物脊髓損傷模型有下列幾種：（1）挫傷型脊髓損傷模型：此種脊髓損傷模型由相關學者在上個世紀初期首次設計的脊髓背側打擊模型[7]。該模型主要利用不同重量的砝碼從不同高度沿著套管垂直落下打擊大鼠脊髓背側造成不同程度的損傷。模型的最大不足之處在于影響因素復雜，操作重復性較差，譬如：同樣的勢能造成的損傷程度并不一致，且在打擊瞬間撞擊錘與脊髓相接觸的面積不一。（2）鉗夾型脊髓損傷：為一種急性脊髓擠壓性損傷模型[8]。模型主要是通過手術方式打開SD大鼠椎板，用動脈瘤夾鉗夾相應的脊髓段。由于該方法需要去除椎板，對動物損傷較大，同時感染機率較大，動物常由于感染而發(fā)生死亡；另外由于鉗夾對脊髓損傷的力度不同，容易造成大鼠下肢全癱，對大鼠術后護理造成很多不便。（3）切割型脊髓損傷模型：與鉗夾型脊髓損傷模型類似，也需要通過手術打開椎板，暴露相應脊髓[9]。脊髓暴露后，采用銳利的虹膜刀片或者顯微剪全橫斷或半橫斷脊髓。該模型手術步驟較復雜，對大鼠的損傷較大，且用刀片對脊髓的橫斷面較整齊，與臨床實際病例有一定差異。（4）脊髓缺血及再灌注模型：與前述脊髓損傷模型的不同在于，該模型主要采用夾閉降主動脈造成脊髓缺血造成脊髓損傷[10]。但是阻斷脊髓供血的同時也造成了血管阻塞及其他組織器官的損傷，影響了隨后脊髓損傷行為學的觀察。

本實驗中所采納的脊髓損傷模型與上述各種模型相比而言具有以下優(yōu)點：（1）皮膚創(chuàng)面較小，且不需打開椎板進行操作。由于不破壞椎板的完整性，因此大鼠出血量很少，術后很少發(fā)生椎管內感染，動物存活時間較長。（2）利用自制改良的注射器針頭插入棘突間隙進行損傷，操作難度較小，且定位準確，損傷力度基本一致，既可以進行半離斷性損傷，也可以進行全離斷性損傷，由于損傷的可控性較好，術后并發(fā)癥較少。（3）注射器針頭造成的損傷屬于不規(guī)則性損傷，損傷斷端更符合臨床實際。（4）自制改良的1 mL注射器針頭容易制作，技術難度較小，操作容易，重復性較好，造成的感覺運動功能障礙明顯[11]。另外，模型整體操作對大鼠的損傷小，傷口自愈時間短。（5）模型最大的特點是可以通過注射針頭所連接的注射器在損傷的部位注射藥物，對神經營養(yǎng)因子或神經干細胞等干預損傷，為探討臨床新的治療脊髓損傷的新藥制劑提供了良好的實驗基礎，并可在此基礎上探討脊髓神經損傷后再生機制。模型制作同時局部注射藥物或制劑進行干預是本模型的獨特所在[12-13]。

總之，本模型的建立屬于大鼠脊髓損傷模型的新方法之一，主要解決現有模型中存在的諸多弊端。利用注射器針頭造成的脊髓損傷模型操作簡便，損傷較小，重復性高，功能障礙顯著，同時，由于模型動物術后感染機率低、并發(fā)癥少、存活率高、可重復性好，有良好的推廣使用前景。模型的建立為今后研究具有刺激或促進脊髓再生的藥物或制劑提供了良好的條件及環(huán)境，為探索臨床藥物的分子作用機理提供實驗基礎。

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New Model for Lateral Lumbar Spinal Cord Injury in Rats

QI Chao，LI Xia-qing，ZHANG Hong.// Medical Innovation of China，2015，12（07）：014-017

Objective：To investigate a lateral spinal cord injury model with less trauma and better replication. The model would be usefull for the study of various new medicines or stem cell therapy on spinal cord injury.Method： A modified self-made needle was used to insert into lumbar spinal cord of SD rats without opening the cavum medullare，the lateral spinal cord injury was established.The grasping ability （movement function） and sensory function by temprature of hind-limbs were measured and compared with contralateral side at different time points after injury for insure the model was successfully.Result：It showed that lateral spinal cord injury model of rats appeared obvious lateral paralysis ，but without incontinence of urine and defecation. Also none of them had infection locally or systemically. The model was successfully.Conclusion：The spinal injure model made by self-made modified needle insertion into SD rats lumbar spinal cord is easy to handle ，repeat，and induce obvious lateral paralysis without severe complications.Due to its advantage of connecting， some medicines or stem cells could be injected conveniently at the same time while surgery processed，then provides an experimental basis to explore the molecular mechanism of spinal cord injury regeneration difficulty.

Sprague Dawley rat； Spinal cord injury； Spinal lateral amputation

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.07.005

2014-11-18） （本文編輯：周亞杰）

國家自然科學基金面上項目（81171178）；山西省自然科學基金項目（2012011036-3）；山西省留學人員科研資助項目（2012-047）

①山西醫(yī)科大學 山西 太原 030001

李夏青

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China