植物乳桿菌發(fā)酵玉米低聚肽乳飲料的研制

李婷,任歡,滿朝新,趙思雨,張立冬,李理,劉少敏,姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學a.食品學院；b.國家乳業(yè)工程技術研究中心，哈爾濱150030）

0 引言

近幾年GABA由于其多種多樣的益生功能受到人們的關注。GABA具有降血壓[1-2]、抗抑郁和減肥等功效[3]。其需求量也在逐年增加，人們通常采用乳酸菌發(fā)酵添加了谷氨酸的食物發(fā)酵而得來[4-6]。但是，味精味過重影響了其產(chǎn)業(yè)化應用。

玉米低聚肽是從玉米蛋白經(jīng)水解獲得的小分子多肽功能性物質，富含谷氨酸（16%）,[7]，其中谷氨酸正是γ-氨基丁酸合成的前體。

大多數(shù)研究只是把玉米低聚肽經(jīng)調和后直接制成飲料[8,9]，本研究創(chuàng)新地將玉米低聚肽作為發(fā)酵底物，利用分離自內蒙古通遼地區(qū)傳統(tǒng)的乳制品中的具有高產(chǎn)GABA能力的植物乳桿菌NDC75017進行發(fā)酵，制得富含GABA的活菌型乳飲料,并對其發(fā)酵工藝及脫苦工藝進行初探，不但解決了傳統(tǒng)GABA發(fā)酵乳制品味精味過重的問題，還有利于玉米深加工原料的應用和發(fā)展。

1 實驗

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌NDC75017分離自內蒙古通遼地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品。

甜玉米市售；玉米肽由山東天驕生物技術有限公司提供：甜乳清粉由河南金潤食品添加劑有限公司提供。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g,牛肉膏5 g,酵母粉5 g,胰蛋白胨10 g,Tween-80 1 mL,葡萄糖 20 g，磷酸氫二鉀2 g,檸檬酸氫二銨2 g,乙酸鈉5 g,硫酸鎂0.5 g,硫酸錳0.25 g，蒸餾水定容至1 000 mL,調pH值至5.8。121℃滅菌15 min，用于菌體的活化。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基添加質量濃度為20 g/L的瓊脂粉，121℃滅菌15 min，用于菌體的計數(shù)。

食品級活性炭、β-環(huán)糊精和堿性蛋白酶。

γ-氨基丁酸標品（Sigma公司）及色譜級甲醇和四氫呋喃

1.2 主要儀器與設備

BCN1360型生物潔凈工作臺，GL-21M高速冷凍離心機，DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，Waters 2695 GPC高效液相儀；Hypersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，分析天平，滅菌鍋，精密天平，精密pH計。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

從-80℃取出植物乳桿菌NDC75017復蘇純化。30℃，14 h活化兩代后用質量濃度為8.5 g/L氯化鈉溶液清洗兩次，重新懸浮于飲料基質中，配置成母發(fā)酵劑，使得菌株活力維持在109mL-1左右。

1.3.2 玉米汁的制備

水果玉米脫粒清洗，用沸水預煮5 min,再按照料液比=1∶3的比例磨漿，最后90℃滅菌30 min后，冷卻備用。

1.3.3 玉米肽的制備

玉米肽的制備參考李鴻梅等人的方法并稍有改動[10]。簡要敘述如下：將玉米蛋白粉過60目篩后，利用質量濃度為40 g/L的碳酸鈉以16 mL/g的添加量添加后在40℃下脫脂處理10 min后離心留取沉淀，在將沉淀與水和堿性蛋白酶按照沉淀∶水∶堿性蛋白酶=50∶500∶1的比例混合，再在50 ℃下酶解4 h，酶解pH=8.0，酶解結束后在90℃下滅酶15 min，離心保留上清液。

1.3.4 發(fā)酵

以3%（v/v）的接種比例將母發(fā)酵劑分別接種于以下兩種發(fā)酵底物：飲料基質A：質量濃度80 g/L的甜乳清粉、體積分數(shù)為50%上述玉米肽和濃度為20 μmol/L的磷酸吡哆醛。飲料基質B：質量濃度為80 g/L%甜乳清粉、體積分數(shù)為50%上述玉米汁和濃度為20 μmol/L磷酸吡哆醛；30℃發(fā)酵68 h后，4℃下備用。

1.3.5 玉米肽脫苦實驗

酶法水解得到的玉米肽會產(chǎn)生苦味，產(chǎn)生苦味的物質是一些短肽類的苦味肽，常常采取活性炭吸附法或者β-環(huán)糊精包埋法去除苦味物質。根據(jù)趙晨霞和隋玉杰的方法稍作改動去除苦味[11,12]，簡要步驟如下，活性炭吸附組：在玉米肽中添加質量濃度為100 g/L過100目篩的活性炭粉，調節(jié)pH值至3.0，30℃吸附2 h，并定時攪拌，轉速為5 000 r/min離心10 min留上清；β-環(huán)糊精包埋組：在玉米肽溶液中添加質量濃度為20 g/L的β-環(huán)糊精，50℃包埋30 min,并定時攪拌。將脫苦處理后的玉米肽作為底物發(fā)酵，并觀察各指標的變化。

1.3.6 GABA檢測

將發(fā)酵液離心（4℃，10 000 r/min，20 min）保留上清，通過0.45 μm的濾膜后上機檢測，參考薛玉清等人的檢測方法[13]，主要是利用GABA與鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde,OPA）發(fā)生衍生反應生成具有較強紫外吸收性的物質，該衍生物溶于流動相溶液，并可用C18反相高效液相色譜柱分離。檢測過程如下：樣品與衍生試劑按1∶10比例充分混合后，室溫靜置反應1 min,0.22 μm濾膜過濾，運用Waters 2695-2487高效液相色譜系統(tǒng)檢測。其中流動相為醋酸鈉緩沖液（0.05 mol/L）∶V（甲醇）∶V（四氫呋喃）=50∶49∶1；流速為1 mL/min；紫外檢測波長為338 nm；柱溫為30℃。

1.3.7 活菌計數(shù)

利用平板計數(shù)法計算發(fā)酵后的菌體數(shù)量。將發(fā)酵液進行梯度稀釋，選擇合適梯度進行平板涂布，30℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。結果用活菌數(shù)對數(shù)（mL-1）表示。

1.3.8 感官評定

結合飲料常用的感官評定標準及發(fā)酵玉米肽乳飲料的特點，感官評定標準如表1所示[9]。

表1 感官評定標準

1.3.9 貯藏穩(wěn)定性

以質量濃度為80 g/L的甜乳清粉和體積分數(shù)為50%的脫苦后的玉米肽為基質制備發(fā)酵乳飲料飲料。觀察飲料在4℃下冷藏21 d內的GABA及活菌數(shù)的變化。

1.3.10 統(tǒng)計分析

試驗過程每組做3個平行；采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行顯著性差異分析；數(shù)據(jù)計算、繪圖采用Microsoft Excel 2007。

2 結果與分析

2.1 玉米肽的制備

經(jīng)過酶解處理后的酶解液澄清、溶解性良好，略有苦味?？梢杂糜诤罄m(xù)的發(fā)酵試驗。

2.2 飲料基質種類選擇

植物乳桿菌NDC75017在含玉米肽和玉米汁的不同基質中，發(fā)酵后的GABA和活菌數(shù)如圖1所示。菌株在甜乳清+玉米肽的基質中GABA產(chǎn)量顯著地高于甜乳清+玉米汁組，達到15.97 mg/100 mL,說明玉米肽比玉米汁更有利于GABA的積累。這是由于GAD酶對于谷氨酸鹽底物的偏好性[14]，上述基質中L-谷氨酸鹽的含量正是玉米肽＞玉米汁。其中玉米肽和玉米汁中的L-谷氨酸鹽是由乳酸菌在發(fā)酵過程中水解得到的。由于玉米肽中氮源含量充足，所以菌體活力在玉米肽中較高，但口感較玉米汁差?；谝嫔δ芗翱诟械木C合考慮，選擇甜乳清和玉米肽作為發(fā)酵基質，并對其脫苦工藝進行初探。

圖1 玉米汁與玉米肽對于GABA和活菌數(shù)及口感的影響

2.3 玉米肽脫苦

基于圖1感官評定的結果，為了提高玉米肽的口感，對玉米肽進行脫苦處理。玉米肽采用活性碳吸附和β-環(huán)糊精包埋處理后，發(fā)酵后的GABA、活菌數(shù)及口感如圖2所示。兩種處理對于菌體活力沒有顯著影響，但是活性碳處理組GABA的積累顯著低于β-環(huán)糊精處理組，有報道證實其與氮源大量損失有關[11]。兩種處理方法均可達到去除苦味的效果。

圖2 活性炭及β-環(huán)糊精脫苦效果的比較

2.4 GABA的含量水平及貯藏穩(wěn)定性

以質量濃度為80 g/L的甜乳清粉和體積分數(shù)為50%脫苦后的玉米肽為基質制備飲料在4℃貯藏21 d里GABA及活菌數(shù)變化如圖3所示。由圖3可以看出，在貯藏期間GABA及活菌數(shù)都稍有減少，但是，GABA仍在（10～12）mg/100 mL以上，可以起到益生作用?；罹鷶?shù)也維持在107mL-1以上，高于國家標準（106mL-1）。

圖3 4℃下貯藏21天GABA及活菌數(shù)變化

3 結論

實驗以分離自內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中具有高產(chǎn)GABA能力的乳酸菌Lactobacillus plantarum NDC75017為發(fā)酵劑，通過比較口感、活菌數(shù)和GABA，選擇酶解法獲得的玉米肽和乳清粉為發(fā)酵基質，發(fā)酵制得富含GABA的乳飲料。實驗對玉米肽的脫苦方法進行研究，結果表明兩種處理方法均可以達到脫苦效果并且對于菌體活力沒有顯著影響，但是活性炭處理組GABA的積累顯著低于β-環(huán)糊精處理組，因此選擇β-環(huán)糊精作為脫苦劑。飲料貯藏2 1d后GABA可以維持在14 mg左右。乳酸菌的活菌數(shù)在貯藏21 d后可以維持在107mL-1以上，高于國家標準（106mL-1）。研究證實酶法水解制備的玉米肽可以作為乳酸菌發(fā)酵底物，并且其發(fā)酵飲料可以獲得益生物質GABA以及一定數(shù)量的乳酸菌，為以后玉米肽發(fā)酵飲料的進一步研發(fā)提供了一定基礎。

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