膠體金免疫層析法快速檢測(cè)乳制品中三聚氰胺

程國(guó)棟，吳小慧，張宇，李曉丹，吳方舟，王丹，金珠

（1.蒙牛乳業(yè)（馬鞍山）有限公司，安徽馬鞍山243000；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特010000）

0 引言

三聚氰胺（melamine）分子式為C3N6H6，分子量為126.12 u，屬于三嗪類(lèi)含氮雜環(huán)有機(jī)化合物[1]，廣泛用于木材、塑料、涂料，造紙等行業(yè)[2]，具有一定的腎毒性。因其含氮量高達(dá)66.6%，一些不法分子利用“凱氏定氮法”是通過(guò)測(cè)定牛奶中含氮量來(lái)折算蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法漏洞，將三聚氰胺人為添加到生乳中，達(dá)到提高蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)目的，獲得不法利益。

目前檢測(cè)三聚氰胺有ELISA法[3-4]、液相色譜法[5-6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]等。ELISA法對(duì)乳品的檢測(cè)具有局限性，且特異性較差；儀器法雖能精確定量，但前處理繁瑣，設(shè)備昂貴，對(duì)操作人員專(zhuān)業(yè)要求高。

近年來(lái)也有利用膠體金免疫層析法檢測(cè)乳品中三聚氰胺，但集中于生乳和奶粉[10-12]，針對(duì)乳制品研究較少。因此建立膠體免疫層析法檢測(cè)乳制品中三聚氰胺是有必要的，也具有實(shí)際意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要儀器

溫育器，試紙條讀數(shù)儀，移液器，計(jì)時(shí)器，超純水器，漩渦混合儀，電子天平，高效液相色譜儀。

1.2 試劑與耗材

易瑞成品乳三聚氰胺快速試紙條，三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，雙氧水，青霉素G，糊精，銨鹽，碳酸氫鈉，尿素，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)原理

三聚氰胺定性檢測(cè)試紙條應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制膠體金免疫層析的原理（結(jié)構(gòu)如圖1所示）。樣本中的三聚氰胺在流動(dòng)的過(guò)程中與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和硝酸纖維素膜（NC膜）檢測(cè)線（T線）上的三聚氰胺-BSA（牛血清蛋白）偶聯(lián)物的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線與控制線顏色深淺的變化，進(jìn)行結(jié)果的判定。

圖1 三聚氰胺快速試紙條結(jié)構(gòu)

1.3.2 試紙條的驗(yàn)收

取經(jīng)確認(rèn)不含三聚氰胺的12%復(fù)原乳做本底空白樣品，并用其制備質(zhì)量濃度為150 μg/L的三聚氰胺加標(biāo)樣品，用試紙條對(duì)以上兩個(gè)樣品做平行檢測(cè)。當(dāng)復(fù)原乳本底樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性，三聚氰胺加標(biāo)樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，試紙條方可使用。

1.3.3 檢測(cè)步驟

樣品與水1∶1進(jìn)行振蕩混合均勻（如：5 g樣品，加入5 mL水，混勻），待測(cè)。將試紙條從冰箱中拿出，恢復(fù)至室溫。從試紙桶中取出白色微孔，移取300 μL待測(cè)樣品于白色微孔中，用移液器抽吸5～10次，混合均勻；將上述制備好的白色微孔樣液全部轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)的紅色微孔中混勻，置于溫育器中40℃±1℃溫育6 min；溫育結(jié)束后，將試紙條插入到微孔中（吸水海綿端朝下）40℃±1℃溫育7 min；然后從微孔中取出試紙條，輕輕刮去試紙條下端的吸水海綿，進(jìn)行結(jié)果判讀；實(shí)驗(yàn)完畢后，將試紙條放入盒中密封，于2～8℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果判定

試紙條檢測(cè)結(jié)果的判定可分為肉眼判定和讀數(shù)儀讀數(shù)判定兩種方式，具體判定方式可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。

2.1.1 肉眼判定

膠體金免疫層析法結(jié)果的判定如圖2所示：當(dāng)檢測(cè)線（T線）和控制線（C線）均出現(xiàn)紅色條帶時(shí)，若T線的紅色條帶顏色較C線深，為陰性（-），反之則為陽(yáng)性（+）；當(dāng)試紙條T線有紅色帶，C線無(wú)紅色帶時(shí)，為陰性（-），反之當(dāng)試紙條T線無(wú)紅色條帶，C線出現(xiàn)紅色條帶，則為陽(yáng)性（+）；若T線和C線兩條線全無(wú)色帶，則試紙條檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。

圖2 三聚氰胺快速試紙條檢測(cè)結(jié)果的判定

2.1.2 讀數(shù)儀讀數(shù)判定

當(dāng)試紙條上T線和C線顏色相同時(shí)，所對(duì)應(yīng)樣品中三聚氰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為樣品的檢出限，此時(shí)讀數(shù)儀讀數(shù)為1.1，當(dāng)使用讀數(shù)儀讀數(shù)時(shí)結(jié)果大于1.1時(shí)為陰性（-），小于或等于1.1時(shí)為陽(yáng)性（+）。個(gè)別樣品的判讀數(shù)值有所不同，例如：兒童奶樣品，當(dāng)T線與C線顏色相同時(shí)數(shù)值為1.8。

2.2 檢出限實(shí)驗(yàn)

由于目前市場(chǎng)上乳制品種類(lèi)繁多，實(shí)驗(yàn)選取滅菌乳、調(diào)制乳、巴氏殺菌乳、原味酸牛奶和果粒酸牛奶5類(lèi)樣品進(jìn)行檢出限實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。分別取2個(gè)批次的三聚氰胺膠體金試紙條分別對(duì)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50，100，200 μg/kg上述加標(biāo)樣品進(jìn)行重復(fù)6次檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

表1 膠體金免疫層析試紙條檢出限實(shí)驗(yàn)

由表1可以看出，巴氏殺菌乳檢出限為50 μg/kg，滅菌乳、調(diào)制乳，原味酸牛奶的檢出限為100 μg/kg，果粒酸牛奶的檢出限為200 μg/kg。由于每個(gè)乳品加工企業(yè)生產(chǎn)滅菌乳、調(diào)制乳、巴氏殺菌乳、原味酸牛奶和果粒酸牛奶的工藝各不相同，這就造成了樣品基質(zhì)種類(lèi)繁多，為了保證實(shí)驗(yàn)的科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)和準(zhǔn)確性，在日常檢測(cè)工作中應(yīng)該對(duì)每類(lèi)產(chǎn)品的每種產(chǎn)品的檢出限進(jìn)行評(píng)定，以確定相應(yīng)樣品的檢出限。從表1也可以看出，不同批次檢的膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果存在一定的差異，所以在進(jìn)行檢出限評(píng)定時(shí)，至少要選用2個(gè)批次的試紙條進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分別選取滅菌乳、調(diào)制乳、巴氏殺菌乳、原味酸牛奶和果粒酸牛奶樣品中的一種代表性產(chǎn)品進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)選取2個(gè)批次的膠體金免疫層析試紙條，分別檢測(cè)本底樣品，1倍檢出限和2倍檢出限加標(biāo)樣品，每個(gè)樣本使用不同批次的試紙條同時(shí)檢測(cè)6次，結(jié)果如表2所示。

表2 膠體金免疫層析試紙條對(duì)牛奶樣品的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，2個(gè)批次的三聚氰胺檢測(cè)本底樣品時(shí)，結(jié)果均為陰性；檢測(cè)添加三聚氰胺1倍檢出限和2倍檢出限樣本時(shí)，結(jié)果均為陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果一致，重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)各選取上述5類(lèi)樣品中一種代表性產(chǎn)品，分別添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，制成陽(yáng)性樣品。然后用2個(gè)批次三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條分別平行檢測(cè)2次，檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性。對(duì)上述樣品用相同的方法連續(xù)檢測(cè)7 d，檢測(cè)結(jié)果也全部為陽(yáng)性，說(shuō)明三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條日內(nèi)、日間的穩(wěn)定均良好。試紙條保存于2～8℃的環(huán)境中，12個(gè)月保質(zhì)期內(nèi)仍可以特異性檢出陽(yáng)性，并且靈敏度沒(méi)有降低。

2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 陰性干擾

實(shí)驗(yàn)將確定不含有三聚氰胺牛奶樣品制成含有脂肪層、酸敗樣品、質(zhì)量濃度20 mg/L的雙氧水、0.1%碳酸氫鈉、100 μg/kg青霉素G、0.2%糊精、0.1%銨鹽、1%尿素（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的干擾樣品，分別做陰性和陽(yáng)性干擾，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

表3 三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條陰性抗干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 陽(yáng)性干擾

將上述制備的陰性干擾樣品制備成含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200 μg/kg的三聚氰胺加標(biāo)樣品，用膠體金免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)，具體結(jié)果如表4所示。

通過(guò)表3特異性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，尿素對(duì)純牛奶、滅菌乳和巴氏殺菌乳樣本產(chǎn)生了干擾，出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，但其對(duì)酸牛奶未產(chǎn)生干擾。為了進(jìn)一步驗(yàn)證尿素的干擾情況，實(shí)驗(yàn)增加了朱古力牛奶、香草牛奶等液體奶和黃桃果粒酸牛奶、草莓果粒酸牛奶、凝固型原味酸牛奶等發(fā)酵乳的尿素陰、陽(yáng)性抗干擾實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示朱古力牛奶、香草牛奶等液體奶的陰性干擾仍然呈“+”，酸牛奶的陰性干擾呈“-”，所有產(chǎn)品的陽(yáng)性干擾均呈現(xiàn)“+”。由此可以得出尿素對(duì)膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)液態(tài)奶中三聚氰胺存在干擾現(xiàn)象。

2.6 與儀器法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

因膠體金免疫層析試紙條的檢出限于儀器法的檢出限存在一定的差別，目前我國(guó)乳品加工企業(yè)大多采用GB/T 22388-2008中液相法來(lái)檢測(cè)乳及乳制品中三聚氰胺，該方法的檢出為2 mg/kg。我國(guó)食品安全法禁止人為在乳品中添加三聚氰胺，但牛奶可能會(huì)因包材中三聚氰胺的遷移導(dǎo)致檢出三聚氰胺，所以我國(guó)將牛奶中三聚氰胺的限量標(biāo)準(zhǔn)定為2.5 mg/kg，故實(shí)驗(yàn)選擇陰性樣品和添加含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mg/kg的三聚氰胺牛奶樣品來(lái)進(jìn)行試紙條法與液相法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，這樣能夠有效地保證在標(biāo)準(zhǔn)之下兩種方法均能有效檢出。結(jié)果如表5所示。

由表5可以看出，試紙條法檢測(cè)結(jié)果與液相法檢測(cè)結(jié)果相一致，表明試紙條可用于滅菌乳、調(diào)制乳、巴氏殺菌乳和發(fā)酵乳中三聚氰胺的快速篩選檢測(cè)。

2.7 批量檢驗(yàn)結(jié)果

連續(xù)一個(gè)星期使用三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條對(duì)上述5類(lèi)不同品種樣品進(jìn)行檢測(cè)，每天檢測(cè)量為約25個(gè)樣品，實(shí)驗(yàn)過(guò)程均正常，樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性，同時(shí)液相法的檢測(cè)結(jié)果均為未檢出。

2.8 注意事項(xiàng)

為了杜絕檢測(cè)過(guò)程中一些不適宜因素導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)異常，需注意以下幾點(diǎn)：①請(qǐng)勿混用來(lái)自不同批號(hào)的試紙條和試劑微孔，請(qǐng)勿使用超過(guò)保質(zhì)期的試紙條；②試紙條和微孔均為一次性使用，不要觸摸試紙條中央的白色膜面；③對(duì)于發(fā)酵乳，為了讓液體充分浸透海綿，插入試紙條后應(yīng)反復(fù)多次的將白色海綿端緊貼微孔片刻；④遇到樣品層析速度過(guò)慢，第二次溫育時(shí)液體未能上升至C線處時(shí)，可延長(zhǎng)2～3 min溫育時(shí)間；⑤第二步溫育結(jié)束后需在5 min內(nèi)觀察或讀取結(jié)果，超過(guò)時(shí)間結(jié)果判讀無(wú)效；⑥多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，盡可能的保持操作步驟統(tǒng)一；⑦試紙條檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)該選用相關(guān)儀器法進(jìn)行確證。

表4 三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條陽(yáng)性性抗干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 試紙條法與液相法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

3 結(jié)論

通過(guò)一系列性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條法檢測(cè)時(shí)間在20 min內(nèi)，檢出限為50～200 μg/kg，批間重復(fù)性和批內(nèi)重復(fù)性良好，檢測(cè)結(jié)果與液相法檢測(cè)結(jié)果一致。方法簡(jiǎn)便，對(duì)人員專(zhuān)業(yè)技能要求相對(duì)低，靈敏度、穩(wěn)定性和特異性等均達(dá)到了食品中有毒有害物質(zhì)快速檢測(cè)的要求，非常適用于乳品加工企業(yè)對(duì)樣品的粗篩選檢測(cè)工作，為產(chǎn)品盡早的投放市場(chǎng)提供前提保障。

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