牛初乳生長因子粗提物修復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎的研究

劉賓，王曉明，曹鳳波，周晶，霍貴成，楊麗杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis,UC）是未知病因的急性和慢性炎性腸疾病，通常表現(xiàn)為出血性痢疾、腹瀉，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為炎癥、病灶處潰瘍、結(jié)腸黏膜隱窩被破壞。生長因子被認(rèn)為能夠?qū)C治療有益，已經(jīng)證明生長因子能夠保護(hù)和修復(fù)腸道上皮細(xì)胞[1-3]。大量實(shí)驗(yàn)證明外源生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子[3]、胰島素樣生長因子[4]、血小板衍生生長因子[5]，都能對結(jié)腸炎有顯著地治療作用。

牛初乳中含有大量生長因子，如類胰島素生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、上皮生長因子、成纖維生長因子等。本研究通過濃縮牛初乳中多種生長因子混合物灌胃潰瘍性結(jié)腸炎大鼠，研究牛初乳生長因子粗提物對腸粘膜損傷的SD大鼠表象特征、形態(tài)學(xué)、病理組織以及血液中二胺氧化酶和D-乳酸的影響，旨在證實(shí)牛初乳生長因子粗提物能夠修復(fù)愈合損傷腸道黏膜。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料和儀器

牛初乳由黑龍江完達(dá)山松北牧場提供；健康Sprague-Dawley（SD）大鼠（清潔級）45只，雄性，體重質(zhì)量（300±30）g，動物購進(jìn)后在本校生命院動物房飼養(yǎng)適應(yīng)一周后投入實(shí)驗(yàn)，保持飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±2）℃，每天人工燈光照明12 h，標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水；大鼠二胺氧化酶（DAO）酶聯(lián)免疫試劑盒，大鼠D-乳酸酶聯(lián)免疫試劑盒。

低速離心機(jī)LD4-2；300 Ku、100 Ku陶瓷膜超濾儀；AE-30型倒置生物顯微鏡；Model 680型酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 牛初乳生長因子粗提物的提取

將健康母牛分娩后2 d內(nèi)的牛初乳，過濾除雜，離心脫脂（7 000 g，15 min，4 ℃），小心地去除上層脂肪，用濃度為10 mol/L的HCL調(diào)節(jié)pH值至2.5[6]，18 h后再用10 mol/L NaOH調(diào)節(jié)到pH4.6，盡可能使初乳生長因子結(jié)合蛋白釋放出來，4℃，10 000 g，30 min離心，收集乳清。

乳清用300 ku和100 ku陶瓷膜超濾儀進(jìn)行超濾，操作壓力0.15 MPa，流量5 L/h，取膜下超濾滲透液。將所得的提取液進(jìn)行脫鹽處理，采用3500 u的透析袋，將所得產(chǎn)物冷凍干燥后貯存，即為生長因子粗提物。

1.2.2 動物模型的建立

（1）動物分組。將48只SD雄性大鼠（300 g±30 g）隨機(jī)分成4組，每組個12只，即正常對照組（對照組）、MTX模型組（模型組）、牛初乳生長因子粗提取物-MTX治療組（治療組）、柳氮磺胺吡啶（SASP組）。

（2）大鼠腸炎模型建立。正常對照組飲用蒸餾水，其余3組大鼠自由飲用蒸餾水配制的5%DSS溶液7 d，參照Cooper[7]等的方法建立大鼠UC模型。

建模后，SASP組和治療組按照成人藥量的0.018倍藥量溶于2 mL飲用水后灌胃，連續(xù)灌胃7 d，每天1次進(jìn)行干預(yù)。分別在造模后第3、5和7天處死大鼠，進(jìn)行指標(biāo)分析。

1.2.3 大鼠的表象觀測

在大鼠灌胃期間，每天觀察并記錄各組大鼠生長狀態(tài)，包括進(jìn)食情況、外觀毛發(fā)、糞便形態(tài)和體重。實(shí)驗(yàn)過程第3、5和7天時(shí)，根據(jù)動物疾病活動指數(shù)（DAI）[8]，結(jié)合動物的體質(zhì)量下降百分率（體質(zhì)量不變?yōu)?，1～5為1分，5～10為2分，10～15為3分，大于15為4分）、大便黏稠度（正常為0.松散的大便為2分，腹瀉為4分）和大便出血（正常0分，隱血陽性為2分，顯性出血為4分）三種情況進(jìn)行綜合評分。將3項(xiàng)結(jié)果的總分除以3即得到DAI值。死亡的計(jì)為4分。

1.2.4 病理組織學(xué)分析大鼠腸黏膜組織

將大鼠肛門至盲腸末端的整個結(jié)腸和直腸端快速取出，并用等壓生理鹽水清洗，定長取出末端結(jié)腸，用光滑玻璃棒刮下黏膜，分別收集結(jié)腸和黏膜稱重。

將結(jié)腸末端組織，生理鹽水沖洗腸腔，然后固定于10%中性福爾馬林溶液中，常規(guī)脫水，用二甲苯觀察組織塊至透明為止，石蠟包埋，切片機(jī)切片，置水槽中展片、撈片和貼片，約6 μ m厚，HE染色后光鏡下組織學(xué)檢查。參考Park等[9]標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)腸組織固有層分離、中性粒細(xì)胞浸潤，絨毛脫落、壞死，血管擴(kuò)張，間質(zhì)水腫，分為0～8級：0級，正常黏膜、組織結(jié)構(gòu)正常；l級，絨毛頂部上皮下產(chǎn)生間隙或固有層分離；2級，上皮下間隙擴(kuò)大；3級，上皮部分絨毛脫落；4級，絨毛脫落明顯；5級，絨毛消失伴隨壞死；6級，隱窩組織形成梗死；7級，轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)形成梗死；8級，透壁梗死。

1.2.5 大鼠血漿二胺氧化酶（DAO）活性的測定

按試劑盒說明書要求嚴(yán)格操作。

1.2.6 大鼠血漿D-乳酸水平的測定

按試劑盒說明書要求嚴(yán)格操作。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有結(jié)果均經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采Duncan法：兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 初乳生長因子粗提物對腸道損傷大鼠表象的影響

模型組大鼠飲用DSS造成大鼠潰瘍性結(jié)腸炎后，進(jìn)食量明顯減少，行動遲緩，毛發(fā)無光澤，出現(xiàn)水樣稀便、膿血便。對照組食量正常，體重明顯增加，大便成顆粒狀。5 d后逐漸好轉(zhuǎn)，體重逐漸增加，膿血便消失，仍然出現(xiàn)倦怠、稀便。第7天時(shí)，體重恢復(fù)到初始水平，糞便基本成型。治療組和SASP組大鼠，在灌胃初乳生長因子粗提物3 d后，體重已經(jīng)開始增加，進(jìn)食量增加，排便次數(shù)減少，血便減少。第5 d時(shí)，體重已經(jīng)恢復(fù)到初始體重，糞便開始成型，活動量增加。7 d時(shí)，已經(jīng)與正常對照組無明顯差異。由表1看出，第3、5天時(shí)，治療組與SASP組的DAI評分都顯著高于對照組評分，也均顯著低于模型對照組評分，但是治療組與SASP之間無顯著性差異（P=0.521,1.000）。第7天時(shí)，治療組和SASP組與對照組無顯著性差異（P=0.280），而仍與模型組大鼠DAI評分呈顯著性差異，說明初乳生長因子能加速治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎。

表1 潰瘍性結(jié)腸炎大鼠DAI和Park評分比較

2.2 腸粘膜組織學(xué)形態(tài)觀察

由圖1可知，正常對照組小鼠直結(jié)腸組織見腺體排列整齊，隱窩正常，杯狀細(xì)胞無減少，未見黏膜糜爛、出血。模型組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞明顯萎縮，絨毛變鈍，甚至消失，且伴隨著多孔性帶有液泡的細(xì)胞出現(xiàn)。治療組和SASP組大鼠結(jié)腸表現(xiàn)出較輕的癥狀，保持了較完整的黏膜結(jié)構(gòu)，絨毛缺失較少，隱窩開始重塑，無炎性細(xì)胞浸潤。由表1可知，治療組與SASP組在第3天的Park評分顯著高于對照組，也均顯著低于模型組，而治療組與SASP組之間無顯著性差異（P=0.073），而第7天時(shí)，治療組和SASP組的Park評分與對照組無顯著性差異（P=0.146），而治療組和SASP組與模型組呈顯著性差異。說明初乳生長因子粗提物對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎有治療作用。

圖1 大鼠腸道組織學(xué)變化（HE,×100）

2.3 結(jié)腸外觀形態(tài)觀察

圖2為牛初乳生長因子粗提物對結(jié)腸及其黏膜的影響。由圖2可以看出，與對照組相比，在第3天時(shí)，治療組與SASP組結(jié)腸的質(zhì)量都顯著下降，分別下降28.28%和28.39%，結(jié)腸黏膜的質(zhì)量下降更為顯著，分別下降了36.57%和27.69%，模型組結(jié)腸及其黏膜質(zhì)量下降更為顯著，治療組與SASP組之間無顯著性差異。第5天時(shí)，模型組和治療組結(jié)腸與結(jié)腸粘膜的質(zhì)量仍然顯著低于對照組，但明顯增加。第7天時(shí)，治療組和SASP組結(jié)腸和結(jié)腸黏膜質(zhì)量已經(jīng)與對照組無顯著性差異（P=0.09,P=0.462），而模型組仍與對照組呈顯著性差異。

圖2 對結(jié)腸的影響

圖3 對結(jié)腸黏膜的影響

2.4 血漿二胺氧化酶（DAO）活性

圖3為牛初乳生長因子粗提物對大鼠血漿DAO活性的影響。由圖3可以看出，第3天和第7天時(shí)，治療組和SASP組DAO活性明顯高于對照組，顯著性低于模型組，且治療組與SASP組DAO活性也呈顯著性差異。第7天，治療組和SASP組DAO活性大幅度下降，仍顯著高于對照組，但是顯著低于模型組DAO活性，此時(shí)，治療組和SASP組DAO活性無顯著性差異（p=0.110）。說明初乳生長因子粗提物能夠加快修復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎腸道。

圖4 對大鼠血漿DAO活性的影響

2.5 血漿D-乳酸水平

圖4為牛初乳生長因子粗提物對大鼠血漿D-乳酸質(zhì)量濃度的影響。由表4可以看出，第3天和第5天治療組和SASP組血漿中D-乳酸濃度顯著高于對照組，顯著低于模型組，而且治療組與SASP組呈顯著性差異。第7天時(shí)，治療組和SASP組D-乳酸質(zhì)量濃度大幅度下降，分別下降了35.25%與51.71%，與模型組呈顯著性差異，而且治療組和SASP組D-乳酸質(zhì)量濃度仍與對照組成顯著性差異。說明初乳生長因子粗提物能顯著加快受損潰瘍性結(jié)腸黏膜修復(fù)和愈合。

圖5 對大鼠血漿D-乳酸質(zhì)量濃度的影響

2.6 討 論

大量研究結(jié)果顯示潰結(jié)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生是多方面因素共同作用的結(jié)果，潰瘍性結(jié)腸炎的潰瘍的愈合過程極為復(fù)雜，其愈合過程包括清除潰瘍后所形成的變性壞死的結(jié)腸組織，潰瘍基底部肉芽組織增生，潰瘍處新生的毛細(xì)血管和血管生成，進(jìn)而潰瘍處纖維結(jié)締組織增生及潰瘍處瘢痕組織的形成，潰瘍周圍結(jié)腸上皮的單層柱狀上皮長入等過程[10]。

潰瘍愈合受到各種調(diào)控因子和細(xì)胞參與。Tarnawski[11]等動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示在EGF的調(diào)控下，潰瘍性結(jié)腸炎的潰瘍組織癱痕的上皮化和結(jié)腸組織腸腺結(jié)構(gòu)的重建過程才得以完成。Luck等[12]對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型體內(nèi)注射EGF連續(xù)7d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGF能明顯減輕結(jié)腸的潰瘍和炎癥。肌肉注射EGF能減輕大鼠乙酸性結(jié)腸炎的黏膜損傷指數(shù)，減少炎癥時(shí)產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)（LPO）、髓過氧化物酶（MPO），預(yù)防修復(fù)結(jié)腸損傷，對腸黏膜細(xì)胞具有保護(hù)作用[13]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，初乳生長因子粗提物能夠降低DAI和Park分?jǐn)?shù)，大鼠進(jìn)食量增加、體重、活動量逐漸增加，糞便成塊，毛發(fā)變亮，第7天時(shí)，治療組DAI評分已經(jīng)與對照組無顯著性差異，而模型組仍有顯著的炎癥性癥狀。

炎癥性腸道疾病是由于腸道黏膜屏障功能遭到破壞，恢復(fù)和改善腸道功能是治療的炎癥腸道疾病的目標(biāo)本之一[14]。光鏡下對大鼠結(jié)腸切片觀察發(fā)現(xiàn)，第3天模型組大鼠腸黏膜嚴(yán)重?fù)p壞，絨毛變鈍，隱窩破壞并伴隨著明顯的腸腔多空，上皮細(xì)胞出現(xiàn)液泡，第5天時(shí)，治療組大鼠隱窩開始重塑，絨毛再生，絨毛間隙緊密。第7天時(shí)，腸絨毛高度增長、緊密排列，隱窩完整，與對照組無顯著性差異，說明初乳生長因子粗提物對潰瘍性結(jié)腸炎具有治療修復(fù)作用。

TGF-α和TGF-β2已經(jīng)被證實(shí)能顯著增加損傷空腸和回腸及其黏膜質(zhì)量[15,16]。本實(shí)驗(yàn)對結(jié)腸及其黏膜進(jìn)行分離稱重，結(jié)果表明潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸及其黏膜重量明顯下降，模型組大鼠結(jié)腸和黏膜重量下降了接近對照組一半。灌胃初乳生長因子粗提物3天后，治療組大鼠結(jié)腸及其黏膜重量已經(jīng)顯著增加，與模型組呈顯著性差異。第7天，治療組已經(jīng)與對照組無顯著性差異，說明治療組大鼠潰瘍性結(jié)腸炎已經(jīng)治愈，表明初乳生長因子粗提物還能夠加速修復(fù)損傷的潰瘍性結(jié)腸炎。

DAO是人類和哺乳動物腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，其活性與小腸絨毛高度和黏膜細(xì)胞的核酸和蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)，是腸黏膜細(xì)胞的標(biāo)志酶，約95%存在于哺乳動物小腸絨毛上層，在共他組織中則含量少、活性低[17]。生理狀況下血漿中DAO活性很低。在腸黏膜受損時(shí)，由腸黏膜細(xì)胞釋放的DAO大量入血，使血中濃度大幅上升，反映小腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性和損傷程度。D-乳酸是腸道內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種物質(zhì)，哺乳動物組織不產(chǎn)生D-乳酸，且缺乏代謝該物質(zhì)的酶系統(tǒng)，不能代謝該物質(zhì)。在腸黏膜屏障正常時(shí)，血漿D-乳酸極低，只有當(dāng)腸黏膜屏障受破壞時(shí)，D-乳酸透過腸過腸黏膜屏障入血，使血漿D-乳酸快速升高。因此，血漿D-乳酸水平可間接反映腸黏膜屏障功能，可作為腸道黏膜損傷指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)中，灌胃牛初乳生長因子粗提物3d后，治療組大鼠的DAO活性和D-乳酸質(zhì)量濃度顯著下降，已經(jīng)與模型組呈顯著性差異。第7天后，治療組DAO活性和D-乳酸質(zhì)量濃度大幅度下降，而與模型組呈顯著性差異，但與SASP組無顯著性差異，說明初乳生長因子對潰瘍性結(jié)腸炎有明顯的治療效果。

3 結(jié)論

本研究證實(shí)牛初乳生長因子粗提物能夠降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的DAI和Park評分，維持結(jié)腸組織形態(tài)完整性，增加結(jié)腸及其黏膜質(zhì)量，增加結(jié)腸組織絨毛長度及隱窩深度，加大吸收面積。能使血漿中DAO活性及D-乳酸質(zhì)量濃度降低，愈合損傷的結(jié)腸腸道，維持了腸道完整性，通透性腸道降低。因此初乳生長因子粗提物具有治療和改善結(jié)腸損傷的功能。

[1]KONTUREK S J,BRZOZOWSKI T,MAJKA J,et al.Fibroblast growth factor in gastroprotection and ulcer healing：interaction with sucralfate[J].Gut,1993,34：881-887.

[2]MUSTOE T A,LANDES A,CROMACK D T,et al.Differential acceleration of healing of surgical incisions in the rabbit gastrointestinal tract by platelet-derived growth factor and transforming growth factor,type beta[J].Surgery,1990,108：324-30.

[3]MURTHY S,COOPER H,COPPOLA D,et al.Transforming growth factor beta2（TGFB）,but not epidermal growth factor（EGF）yields protection against dextran sulfate（DSS）-mediated colitis in mice[J].Gastroenterology,1992,102：A669.

[4]HOWARTH G S,XIAN C J,Read L C.Insulin-like growth factor-I partially attenuates colonic damage in rats with experimental colitis induced by oral dextran sulphate sodium[J].Scand J Gastroenterol,1998,33（2）：180-190.

[5]SANDOR Z,KUSSTATSCHER S,SZELI D,et al.The effect of thrombocyte-derived growth factor on experimental inflammatory bowel disease[J].Orv Hetil,1995,136：1059-61.

[6]TAYLOR V L,GODDARD C,READ L C.A milk growth factor ex-tract reduces chemotherapeutic drug toxicity in epithelial cells in vitro[J].In Vitro Cellular and Developmental Biology.Animal,2001,37（5）：310-318

[7]EGGER B,BAJAJ-ELLIOTT M,MACDONALD T T,et al.Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis：cytokine profile and dose dependency[J].Digestion,2000,62（4）：240-8.

[8]MURANO M,MAEMURA K,HIRATAL I,et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappaB（p65）antisense oligonucleotide on mouse dextransulphate sodium（DSS）-induced colitis[J].Clin Exp Immunol,2000,120（1）：51-58.

[9]PARK P O,HAGLUND U,BULKLEY G B,et al.The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion[J].Surgery,1990,107（5）：574-578.

[10]TARNAWSKI A,TANOUE K,SANTOS A M,et al.Cellular and molecular mechanisms of gastric ulcer healing.Is the quality of mucosal scar affected by treatment[J].Scand J Gastroenterol Suppl,1995,210：9-14.

[11]TARNAWSKI A,DOUGLASS.Quality of gastri culcer health histological ultrastructural assessment[J].Aliment Pharmacol Ther,1991,5（1）：79-90.

[12]LUCK M S,BASS P.Effect of epidermal growth factor on experimental colitis in the rat[J].The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,1993,264（2）：984-1074.

[13]林軍,鄧長生,陳德基.表皮生長因子與谷氨酰胺對大鼠乙酸性結(jié)腸炎的影響[J].中國病理生理雜志,1997,13（3）：278-281.

[14]BRUEWER M,LUEGERING A,KUCHARZIK T,et al.Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis independent mechanisms[J].Journal of Immunology,2003,171（11）：6164-6172.

[15]IGOR S,DAN S,SHANI B L,et al.Transforming growth factor-alpha stimulates enterocyte proliferation and accelerates intestinal recovery following methotrexate-induced intestinal mucositis ina rat[J].Pedia Surg Int,2008,24：1303-1311.

[16]SHANI B L,YULIA P,JORGE M,et al.Dietary Transforming Growth Factor-Beta 2（TGF-β2）Supplementation Reduces Methotrexate-Induced Intestinal Mucosal Injury in a Rat[J].PloS one,2012,7（9）：e45221.

[17]HUA J S,ZHENG P Y,FONG T K,et al.Helicobacter pylori acquisition of metronidazole resistance by natural transformation in vitro[J].World J Gastroentero,1998,4（5）：385-387.