平菇各生長期菌質(zhì)中低聚木糖的提取工藝研究

呂文亭， 于明鶴， 王國輝

（1.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院，河北張家口 075131；2.文安縣畜牧獸醫(yī)局，河北廊坊 065800）

平菇菌質(zhì)是以稻草、棉籽殼、玉米芯等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品為主要原料栽培平菇后的剩余培養(yǎng)基 （許艷麗等，2015）。我國平菇栽培極為廣泛，平菇菌質(zhì)資源豐富，卻未得到有效利用（宮福臣等，2012）。低聚木糖 （XOs）是一種新型的功能性低聚糖添加劑，具有促進腸道有益菌增殖、抑制有害菌生長、提高動物生產(chǎn)性能和機體免疫力等獨特的生理功能（孫羅美等，2012）。研究表明，食用真菌能在生長繁殖過程中，產(chǎn)生大量的胞內(nèi)酶和胞外酶，將稻草等培養(yǎng)基中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等高分子物質(zhì)降解成單糖、雙糖及低聚糖等低分子物質(zhì)，使培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分含量大幅度提高 （岳新葉等，2005）。本試驗以各生長時期的平菇菌質(zhì)為原料，以菌質(zhì)的顆粒細度、浸泡時間、浸煮時間和處理液的pH值為影響因素，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，篩選出平菇菌質(zhì)中XOs的最佳提取工藝，為增加平菇菌質(zhì)的附加值，實現(xiàn)平菇菌質(zhì)的推廣和XOs產(chǎn)品的低成本應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要設(shè)備 各生長時期平菇菌質(zhì)，由河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院提供。

95%低聚木糖（XOs）標(biāo)準(zhǔn)品（山東龍力生物科技有限公司）；3，5-二硝基水楊酸 （化學(xué)純）；NaOH、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、鹽酸和NaHCO3均為分析純。

101C-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱 （上海實驗儀器廠）、UV755B型紫外可見分光光度計 （上海分析儀器總廠）、SHA-C型水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇中大儀器廠）、LD4-2型低速離心機 （北京醫(yī)用離心機廠）、調(diào)節(jié)式萬用電爐（上海華聯(lián)環(huán)境試驗設(shè)備公司恒昌儀器廠）、DS-1型高速組織搗碎機（上海標(biāo)本模型廠）、6511型電動攪拌機（上海標(biāo)本模型廠）、JY3002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、FA1104型上皿電子天平（上海天平儀器廠）、JZ7114單相感應(yīng)電動機（上海微型電機廠）、pHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 10 mg/mL XOs標(biāo)準(zhǔn)液的制備 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的95%XOs標(biāo)準(zhǔn)品1052.632 mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 3，5-二硝基水楊酸試劑的制備 6.3 g 3，5-二硝基水楊酸和262 mL 2 mol/L NaOH溶液，加到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結(jié)晶酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解。冷卻后加蒸餾水定容至1000 mL，貯于棕色瓶中備用。

1.2.3 XOs標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按表1要求取24支具有25 mL刻度的試管分成3組，分別加入不同劑量10 mg/mL XOs標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水，最后每個試管加入3，5-二硝基水楊酸試劑1.5 mL，將各管搖勻，在沸水浴中加熱5 min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至25 mL刻度處，搖勻。將第一個試管樣品作為空白對照，在波長540 nm處測定吸光度值。以XOs濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)繪制 XOs標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.2843C+0.0065，R2=0.9999。

表1 XOs標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.4 正交試驗設(shè)計 選取平菇菌質(zhì)的顆粒細度（A）、浸泡時間（B）、浸煮時間（C）和處理液的 pH值（D）4 個因素，采用 L9（34）正交設(shè)計，進行 4 因素3水平試驗 （表2），根據(jù)所測定平菇菌質(zhì)中XOs的含量確定最佳提取工藝條件。

表2 正交試驗因素與水平

1.2.5 待測樣品液的制備 平菇菌質(zhì)→烘干→粉碎→浸泡→浸煮→抽提→濃縮→定容→平菇菌質(zhì)待測樣品液。

具體步驟：在平菇菌絲降解稻草過程中，分別采集各個生長時期的菌質(zhì)樣品，將其剪成小段在干燥箱中80℃烘干后裝袋保存。準(zhǔn)確稱取樣品50 g，按表2正交試驗設(shè)計進行樣品液的制備，搗碎后放入燒杯中20℃浸泡，之后將樣品燒杯放于電爐上煮沸，并用玻璃棒不停攪拌，浸煮后的樣品用單相感應(yīng)電動機進行抽提，反復(fù)抽提3次，收集浸提液，浸提液60℃真空濃縮，在4000 r/min的離心機上離心15 min，然后用蒸餾水定容至50 mL，搖勻，即為待測樣品液。

1.2.6 樣品中XOs含量的測定 采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS 法）（寧正祥，1998），取待測樣品液1 mL、蒸餾水1 mL、3，5-二硝基水楊酸試劑1.5 mL加入25 mL刻度試管中，其余操作均與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，在波長540 nm處測定吸光度值。做3個平行試驗，取平均值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，計算樣品中XOs的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 對所有測定值的差異顯著性進行方差分析（AOV），當(dāng)差異顯著時，用多重比較方法來確定各組間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 直觀分析 稱取9份50 g第三次出菇期平菇菌質(zhì)干燥樣品，進行9種不同試驗處理。由表3可知，按照極差R值的大小，影響提取效果的因素的主次順序為：A＞D＞B＞C （即顆粒細度＞處理液的pH值＞浸泡時間＞浸煮時間），各因素水平的優(yōu)劣順序為：A3＞A2＞A1、B3＞B2＞B1、C3＞C2＞C1、D1＞D3＞D2。

表3 正交試驗設(shè)計與試驗結(jié)果

2.2 方差分析 由表4可見，顆粒細度（A）、pH值（D）對XOs提取效果的影響差異極顯著（P＜0.01）；浸泡時間（B）對XOs提取效果的影響差異顯著（P ＜ 0.05）；而浸煮時間（C）對 XOs提取效果的影響差異不顯著（P＞0.05）。由上述試驗結(jié)果可知，第三次出菇期平菇菌質(zhì)中XOs的最佳提取工藝確定為A3B3C3D1，即平菇菌質(zhì)12000 r/min搗碎，浸泡48 h，浸煮1.5 h，處理液pH值為3.50。

表4 正交試驗設(shè)計方差分析結(jié)果

2.3 各生長時期平菇菌質(zhì)中XOs含量的檢測 根據(jù)正交試驗所確定的最佳提取工藝處理各生長時期菌質(zhì)樣品，再利用DNS法結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)回歸方程即可得到各時期樣品中XOs的含量，試驗結(jié)果見圖1。

圖1 各生長時期平菇菌質(zhì)中XOs含量

由圖1可知，在平菇的整個生長過程中，XOs含量基本呈先上升后下降的趨勢，在第一次出菇期達到高峰。

3 討論與結(jié)論

隨著平菇的規(guī)?；a(chǎn)和栽培技術(shù)的普及，平菇菌質(zhì)已成為數(shù)量十分可觀的一種重要飼料資源，經(jīng)過平菇菌絲體的生物固氮和酶解作用等一系列生物轉(zhuǎn)化過程，平菇菌質(zhì)中粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的含量有所提高，而其中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等均被不同程度地降解，其營養(yǎng)價值得到顯著改善（張純等，2012）。制備XOs的主要原料就是木聚糖類半纖維素，目前XOs的生產(chǎn)多數(shù)是使用化學(xué)方法處理木聚糖后，再進行XOs的酶法水解，此法對工業(yè)規(guī)模和成本有較高要求，而且會產(chǎn)生大量廢水。因此，XOs產(chǎn)品主要應(yīng)用于人類食品添加劑，由于成本較高，在飼料行業(yè)的應(yīng)用受到限制（徐光勝和丁小玲，2013；謝全喜等，2012）。本試驗利用稻草為培養(yǎng)基栽培平菇菌種，通過菌絲體在生長繁殖過程中產(chǎn)生的木聚糖酶降解木聚糖類半纖維素，從而生成XOs。然后通過生理生化方法處理各生長時期菌質(zhì)樣品，從中提取XOs。結(jié)果表明：12000 r/min搗碎，用pH=3.50的酸性液浸泡48 h，再浸煮1.5 h是從平菇菌質(zhì)中提取XOs的最佳處理組合，其中菌質(zhì)的顆粒細度及處理液的pH值對提取XOs的影響最大。

平菇真菌自擔(dān)孢子萌發(fā)后，至少要經(jīng)過三個階段才能完成其整個生活史：即菌絲生長階段、子實體分化和子實體發(fā)育階段（凌麗絹，1995）。本試驗發(fā)現(xiàn)XOs的含量在第一次出菇期達到最高。其原因可能是平菇真菌在生長過程中，所需的碳素營養(yǎng)是通過菌絲體分泌的各種胞內(nèi)酶或胞外酶（如纖維素酶、木聚糖酶等）將稻草基質(zhì)中的纖維素、半纖維素等大分子物質(zhì)逐步降解成可溶性小分子而提供的，菌絲體內(nèi)貯藏的碳源越來越多，為子實體的形成提供基礎(chǔ)，其中纖維素的吸收利用優(yōu)于半纖維素，故XOs的峰值出現(xiàn)在第一次出菇期，但隨著出菇次數(shù)的增加，菌絲不斷生長，基質(zhì)中的養(yǎng)分消耗增多，XOs的含量也逐漸降低，具體機制仍有待于進一步研究。

綜上所述，平菇菌質(zhì)中含有一定量具有眾多優(yōu)良生理活性的低聚木糖，增加了菌質(zhì)的附加值，經(jīng)適當(dāng)加工處理，即可制成一種新型、高效、安全的功能性飼料或飼料添加劑，降低了低聚木糖產(chǎn)品的應(yīng)用成本。進一步開發(fā)和合理利用平菇菌質(zhì)，有利于食用菌生產(chǎn)和畜牧業(yè)的相互促進和共同發(fā)展。

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