C型鈉尿肽對(duì)百草枯致肺纖維化小鼠Toll樣受體4表達(dá)的影響

楊晨，趙文靜，孟天麗

[1.徐州醫(yī)學(xué)院（江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 徐州 221006]

·論著·

C型鈉尿肽對(duì)百草枯致肺纖維化小鼠Toll樣受體4表達(dá)的影響

楊晨1，趙文靜2，孟天麗1

[1.徐州醫(yī)學(xué)院（江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 徐州 221006]

目的觀(guān)察C型鈉尿肽（CNP）對(duì)百草枯（PQ）誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制。方法72只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（D組）、模型組（PQ組）和治療組（CNP組），每組24只。分別于給藥后7、14、21和28 d處死小鼠，收集肺組織，監(jiān)測(cè)小鼠一般情況，Western blot檢測(cè)肺組織Toll樣受體4（TLR4）表達(dá)。結(jié)果與D組相比，PQ組7、14、21和28 d TLR4表達(dá)明顯升高，肺損傷嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CNP組各指標(biāo)無(wú)明顯變化。結(jié)論CNP對(duì)PQ誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化有保護(hù)作用，可能與其抑制TLR4表達(dá)有關(guān)。

C型鈉尿肽；百草枯；肺纖維化；Toll樣受體4

百草枯（Paraquat，PQ）是一種非選擇性的高效接觸性除草劑，對(duì)人畜有較強(qiáng)毒性，PQ中毒后可致肺、腎、肝等多臟器功能損傷，肺是主要受損的靶器官[1]。誤服或自殺服用PQ導(dǎo)致中毒是臨床常見(jiàn)的急危重癥，其具體的中毒機(jī)制尚未明確，無(wú)特效解毒藥物，臨床病死率高達(dá)80%[2]。死亡的首要原因是漸進(jìn)的不可逆肺纖維化引起進(jìn)行性呼吸衰竭[3]。C型鈉尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）是鈉尿肽家族的第3個(gè)成員，由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗炎和抗增殖能力[4]。最新研究表明，Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）活化增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)的敏感性，同時(shí)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增多[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠百草枯中毒致肺纖維化模型，觀(guān)察肺組織TLR4的激活和表達(dá)，旨在從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的角度探討CNP干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品及主要試劑

清潔級(jí)雄性昆明小鼠，8～10周齡，體重30～35 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。百草枯粉劑（上海藥物研究所）純度＞99.4%，CNP（美國(guó)Phoenix Biotech公司），TLR4單抗（美國(guó)ABCOM公司），其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 動(dòng)物分組和模型的建立

小鼠室溫條件下飼養(yǎng)在鼠籠中，保持濕度。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周，使小鼠適應(yīng)環(huán)境，期間密切觀(guān)察。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中自由進(jìn)食、水，用生理鹽水配制成藥物溶液。按隨機(jī)數(shù)字表法將72只雄性昆明小鼠平均分為3組：①對(duì)照組（D組）生理鹽水0.1 ml/d；②模型組（PQ組）百草枯（10 mg/kg）0.1 ml/d；③治療組（CNP組）百草枯（10 mg/kg）0.1ml/d+CNP 3μg/（kg·d）。給藥方式：①腹腔注射生理鹽水+PQ，3 d/次，共5次；②尾靜脈注射CNP，2 d/次，至28 d。各組分別于染毒后7、14、21和28 d處死6只小鼠，打開(kāi)胸腔，取出完整肺組織。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠一般情況實(shí)驗(yàn)期間觀(guān)察小鼠活動(dòng)、精神及呼吸等。

1.3.2 肺組織TLR4蛋白測(cè)定取肺組織制備勻漿，用Western blot檢測(cè)蛋白，蛋白樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加兔抗TLR4多克隆抗體孵育，漂洗，加羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）孵育，再漂洗等步驟后，用化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，在成像儀中觀(guān)察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

D組小鼠活潑好動(dòng)，精神狀態(tài)佳，呼吸平穩(wěn)，毛發(fā)色澤光亮潔凈，體重增加。PQ組小鼠表現(xiàn)為倦怠嗜睡，活動(dòng)少，呼吸急促，毛發(fā)色澤暗淡，體重增加緩慢，早期體重減輕。與PQ組小鼠比較，CNP組小鼠中毒反應(yīng)相對(duì)較輕。

2.2 肺組織TLR4蛋白含量變化

與D組相比，PQ組TLR4蛋白含量顯著升高；CNP組無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖1～4。

圖1 第7天各組TLR4蛋白含量表達(dá)

圖2 第14天各組TLR4蛋白含量表達(dá)

圖3 第21天各組TLR4蛋白含量表達(dá)

圖4 第28天各組TLR4蛋白含量表達(dá)

3 討論

百草枯又名克蕪蹤，為聯(lián)吡啶類(lèi)化合物。1962年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，被世界各國(guó)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，可經(jīng)皮膚、呼吸道、消化道吸收造成急性中毒。PQ中毒2 h后，即出現(xiàn)肺纖維化[6]，早期死于急性肺損傷（acute lung injury，ALI）所致的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），晚期死于肺間質(zhì)纖維化所致的呼吸衰竭[7]。最新研究顯示，PQ中毒致肺纖維化是損傷、炎癥、修復(fù)和肺損傷相互作用的結(jié)果。百草枯中毒的發(fā)病機(jī)制包括兩個(gè)階段，初始階段涉及多個(gè)器官急性損傷，可能會(huì)出現(xiàn)死亡，并與肺、腎、循環(huán)衰竭等有關(guān)。這個(gè)階段的存活患者可發(fā)展到第二階段，其特征幾乎只損傷肺，廣泛的肺纖維化隨之而來(lái)，導(dǎo)致呼吸困難、紫紺、呼吸衰竭，最終死亡。百草枯中毒后，肺組織中PQ濃度比血漿濃度高10～90倍[8]，主要通過(guò)Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管膜上多胺運(yùn)輸系統(tǒng)[9-10]的主動(dòng)攝取而選擇性地在肺內(nèi)聚集，其肺毒性是由一系列氧化還原反應(yīng)循環(huán)及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)所致。

ALI是各種直接或間接因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的非心源性的急性低氧性呼吸功能不全。發(fā)展至嚴(yán)重階段（氧合指數(shù)＜200）稱(chēng)為ARDS。肺纖維化被定義為一種慢性免疫應(yīng)答，其特征在于炎癥、組織重塑和修復(fù)過(guò)程。無(wú)論任何病因，纖維化疾病都有相似之處，包括一個(gè)持久刺激也會(huì)導(dǎo)致結(jié)締組織元素的沉積，從而重塑組織的正常結(jié)構(gòu)。成纖維細(xì)胞參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，并同時(shí)啟動(dòng)纖維化機(jī)制，細(xì)胞外基質(zhì)沉積可以在一定程度上修復(fù)急性炎癥反應(yīng)引起的組織損傷，過(guò)度的沉積則會(huì)引起組織纖維化疾病，并導(dǎo)致一系列結(jié)構(gòu)和功能的改變。PQ誘導(dǎo)的肺纖維化特征是肺血管阻塞、膠原纖維顯著增加和成纖維細(xì)胞在肺泡積聚[11]，是一種慢性、進(jìn)行性、不可逆的間質(zhì)性肺疾病。

CNP最初在豬腦中分離，為22個(gè)氨基酸的多肽，結(jié)構(gòu)與心房鈉尿肽和腦鈉尿肽有關(guān)，三者遺傳性不同，但都具有利尿和舒血管作用[12]。人類(lèi)CNP前體分子包括126個(gè)氨基酸殘基，在種屬間大量存在，鼠、豬和人有95%同源性[13]。CNP主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的具有調(diào)節(jié)血管活性的多種生物學(xué)功能的多肽，其受體廣泛分布于血管平滑肌、心肌、腎臟、腎上腺、骨/軟骨、神經(jīng)元等多器官組織，參與調(diào)節(jié)血管緊張度、組織損傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞保護(hù)及促進(jìn)軟骨骨化等體內(nèi)重要臟器的多種生理功能[14]。CNP是鈉尿肽受體-B唯一的天然配體，對(duì)ALI具有保護(hù)作用[15]。

TGF-β1是公認(rèn)的參與肺纖維化的關(guān)鍵因子[16-17]，誘導(dǎo)膠原合成和基質(zhì)改變，PQ中毒早期即可檢測(cè)到TGF-β1表達(dá)，并在整個(gè)纖維化進(jìn)展的過(guò)程中持續(xù)表達(dá)。TLRs是一種模式識(shí)別受體，廣泛表達(dá)于細(xì)胞表面。TLR4作為已識(shí)別的哺乳動(dòng)物和人類(lèi)共同擁有的10種Toll樣受體之一[18]，能夠激活與適應(yīng)性免疫有關(guān)的基因。在多種臟器纖維化中，TGF-β和TLR4表達(dá)增加且相互作用[19-22]。有研究報(bào)道，TLR4基因失活可明顯減弱膿毒癥癥狀，通過(guò)改善肺順應(yīng)性，阻止肺水腫的形成，改善組織學(xué)變化[23]。

目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中未發(fā)現(xiàn)有關(guān)外源性CNP對(duì)PQ中毒致肺纖維化影響的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，早期給予CNP干預(yù)，可以降低TLR4蛋白的表達(dá)，從而減輕肺組織病理?yè)p傷，具有一定的保護(hù)作用。

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（申海菊 編輯）

Effects of C-type natriuretic peptide on Toll-like receptor 4 expression in mice with Paraquat induced pulmonary fibrosis

Chen YANG1,Wen-jing ZHAO2,Tian-li MENG1
(1.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Anesthesiology,Xuzhou Medical College,Xuzhou, Jiangsu 221004,P.R.China;2.Department of Intensive Care Medicine,the Affiliated Hosptial,Xuzhou Medical College,Xuzhou,Jiangsu 221006,P.R.China)

【Objective】To observe that protective effect of C-type natriuretic peptide(CNP)on Paraquat induced pulmonary fibrosis in mice and its mechanism.【Methods】Totally 72 male Kunming mice were randomly divided into three groups with 24 in each group:control group(D group),model group(PQ group)and treatment group(CNP group).The mice were sacrificed 7,14,21 or 28 days after administration of drug and the lung tissue was collected.The general physical condition was observed.The expression of Toll-like receptor 4(TLR4)was measured by Western blot.【Results】At the corresponding time point,the pathological damage of lung tissue in the PQ group was significantly more severe than that in the D group and the level of TLR4 in the lung tissue in the PQ group were significantly higher than that in the D group(P＜0.05). Those in the CNP group showed no significant changes compared to the D group.【Conclusion】The protective effect of CNP on Paraquat induced pulmonary fibrosis may be related to its inhibition of TLR4 expression.

C-type natriuretic peptide；Paraquat；pulmonary fibrosis；Toll-like receptor 4

R563.9；R595.4

A

1005-8982（2015）29-0035-04

2015-03-03

趙文靜，E-mail：zhaowj886@sina.com