吡非尼酮對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成的影響*

王琳娜，陳常勇，郭存霞，陳小永，陳香美

[1.河南省中醫(yī)院腎病科，河南 鄭州 450002；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院放射科，湖南 長沙 410008；3.中國人民解放軍總醫(yī)院腎臟病科（腎臟疾病國家重點實驗室），北京 100853]

·論著·

吡非尼酮對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成的影響*

王琳娜1，陳常勇2，郭存霞1，陳小永1，陳香美3

[1.河南省中醫(yī)院腎病科，河南 鄭州 450002；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院放射科，湖南 長沙 410008；3.中國人民解放軍總醫(yī)院腎臟病科（腎臟疾病國家重點實驗室），北京 100853]

目的探討吡非尼酮（PFD）對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞（CFB）增殖和Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）合成的影響，探討其抗纖維化作用機(jī)制。方法①體外培養(yǎng)CFB，不同濃度（0、100、200、400、800和1 600μg/ml）PFD加入CFB培養(yǎng)液中24、48和72 h，四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測CFB增殖，篩選PFD最佳作用濃度范圍和作用時間；②根據(jù)以上實驗結(jié)果，選用400和1 600μg/ml PFD加入CFB培養(yǎng)液中48 h作為觀察濃度和干預(yù)時間，實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）和Western blot檢測PFD對TGF-β1誘導(dǎo)CFB增殖、ColⅠmRNA和ColⅠ表達(dá)的影響。結(jié)果與對照組比較，400和1 600μg/ ml PFD能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)CFB增殖、ColⅠmRNA和ColⅠ表達(dá)，400μg/ml即能起顯著抑制作用。結(jié)論P(yáng)FD對CFB增殖和膠原蛋白合成有抑制作用，PFD的抗纖維化作用與其有關(guān)。

吡非尼酮；心肌成纖維細(xì)胞；尿毒癥；Ⅰ型膠原蛋白；轉(zhuǎn)化生長因子-β1

尿毒癥心肌間質(zhì)纖維化（uremic myocardial fibrosis，UMF）是在慢性腎臟病基礎(chǔ)上，并發(fā)心肌肥大和心室重塑的主要病理基礎(chǔ)，是慢性心功能不全難以逆轉(zhuǎn)的原因之一，是影響終末期腎病和血液透析患者生存率的獨立危險因素[1]，因此切實有效的防治措施受到高度關(guān)注。心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFB）是構(gòu)成心肌組織的主要成分，在數(shù)量上占心臟細(xì)胞總數(shù)的70%～80%。病理狀態(tài)下，CFB增殖活化為心臟肌成纖維細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，引起心臟纖維膠原蛋白積聚、膠原蛋白組成成分改變及空間結(jié)構(gòu)排列紊亂，導(dǎo)致心肌纖維化。因此，抑制CFB的增殖和活化，在阻止甚至逆轉(zhuǎn)心肌間質(zhì)纖維化過程中起至關(guān)重要的作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transform growth factor-β1，TGF-β1）是公認(rèn)的致纖維化因子。吡非尼酮（Pirfenidone，PFD）是一種新型的廣譜抗纖維化化合物，PFD的結(jié)構(gòu)是5-甲基-1-苯基2（1氫）-吡啶酮。本實驗通過觀察PFD對TGF-β1誘導(dǎo)CFB增殖和膠原蛋白分泌的影響，探討PFD的抗纖維化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

PFD由中南大學(xué)藥學(xué)院合成，用含10%胎牛血清的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）配制成終濃度為1 600、800、400、200和100μg/ml PFD，分裝后4℃避光保存。DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公司），胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)CS）、胰蛋白酶、重組人TGF-β1、四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國Sigma公司，酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），Rneasy Mini Kit試劑盒（美國Qiagen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），SYBR Premix Ex Taq試劑盒（美國Taraka公司）。

1.2 乳鼠CFB原代培養(yǎng)

取出生1～2 d Wistar大鼠，無菌條件下剪取心室肌，剪碎心肌，0.25%胰酶消化后，加入10%胎牛血清培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/μl，差速貼壁1 h，去除心肌細(xì)胞獲得成纖維細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至融合狀態(tài)后按1∶2傳代，傳代后成纖維細(xì)胞以波形蛋白單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，純度達(dá)到95%用于實驗。細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞長滿后，0.25%胰蛋白酶消化，傳代。取傳2、3代細(xì)胞用于實驗。

1.3 PFD對CFB增殖的影響

處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液200μl，接種密度為1×104個/ml，37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后棄上清液，加入無血清的DMEM作用24 h，使細(xì)胞同步化。設(shè)空白對照孔，加入PFD（0、100、200、400、800和1 600μg/ml），每個濃度均重復(fù)6孔，37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入MTT 20μl（5 ng/ml）。置孵箱中4 h后取出培養(yǎng)板，棄上清液，每孔加DMSO 150μl。用ELISA自動分析儀490nm處測定各孔光吸收度值（opital density，OD），計算6孔的均數(shù)。通過上述實驗，篩選出PFD抑制CFB增長的有效濃度范圍和最佳作用時間。

1.4 PFD對TGF-β1誘導(dǎo)CFB增殖的影響

處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液200μl，接種密度為1×104個/ml，37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，棄上清液，加入無血清的DMEM作用24 h，使細(xì)胞同步化。加入TGF-β1（5 ng/ml），設(shè)空白對照孔，加入PFD（0、400和1 600μg/ml），各濃度均重復(fù)6孔。37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT 20μl（5 mg/ml）。置孵箱中4 h后取出培養(yǎng)板，棄上清液，每孔加DMSO 150μl。用ELISA自動分析儀490 nm處測定各孔OD值，計算6孔的均數(shù)。

1.5 心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白的實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測

1.5.1 細(xì)胞總RNA的提取用Rneasy Mini Kit試劑盒提取細(xì)胞總RNA，抽提的總RNA用紫外分光光度計測OD值，比值為1.9～2.0。取3μl RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳，可見28、18和5 S 3條清晰的RNA帶，提示RNA無污染和降解。

1.5.2 cDNA的合成用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再以該cDNA為模板進(jìn)行實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（teal-tima-PCR，RT-PCR）。RT-qPCR的引物序列如下，β-actin正向引物：5'-GGCCAACCGTGA AAAGATGA-3'，反向引物：5'-GACCAGAGGCATAC AGGGACAA-3'；Ⅰ型膠原蛋白（collagen typeⅠ，ColⅠ）正向引物：5'-TCAGGGGCGAAGGCAACAGT-3'，反向引物：5'-TTGGGATGGAGGGAGTTTACACGA-3'。

1.5.3 RT-qPCR檢測按SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）試劑盒說明書進(jìn)行操作。在ABI 7900型熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，96孔板加樣，設(shè)計復(fù)孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Sequence Detection System軟件分析各檢測樣本的Ct值（達(dá)到一定熒光閾值的循環(huán)數(shù)），計算2-ΔΔCt，評價ColⅠ在CFB中的表達(dá)水平。

1.6 心肌成纖維細(xì)胞ColⅠ的Western blot檢測

1.6.1 細(xì)胞總蛋白質(zhì)的提取培養(yǎng)細(xì)胞棄去上清液，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffer solution，PBS）洗滌后加入細(xì)胞裂解液，裂解30 min。4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，按Bio-rad蛋白定量試劑盒方法進(jìn)行蛋白定量，取80μl上清液加20μl 5×變性緩沖液混勻，100℃下變性10 min。

1.6.2 I型膠原蛋白的Western blot檢測灌制10%分離膠和4%堆積膠，取總蛋白40μg行上樣電泳，電泳結(jié)束后260 mA電轉(zhuǎn)印90 min至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）。封閉液（5%牛奶）搖床上封閉2 h，分別加入羊抗ColⅠ多克隆抗體（1∶200），4℃搖床過夜。洗膜后再加羊二抗，室溫孵育1 h，加ECL液后顯影、定影，以β-actin為內(nèi)參照。將膠片掃描后，采用Quantity One軟件分析各條帶灰度值，將各目的條帶灰度值除以同一標(biāo)本內(nèi)參照β-actin條帶灰度值得到比值，將該比值作為ColⅠ蛋白表達(dá)量的半定量結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFD對CFB增殖的影響

PFD能抑制CFB增殖，與對照組（PFD 0μg/ml）比較，PFD作用24 h時，1 600μg/ml起效[（0.38± 0.09）vs（0.45±0.05）](t=-2.612，P=0.004）；作用48 h時，PFD 400μg/ml[（0.36±0.03）vs（0.50±0.05）]（t=-4.200，P=0.000），PFD 800 μg/ml[（0.30±0.03）vs（0.50±0.05）]（t=-5.171，P=0.000），PFD 1 600μg/ml [（0.28±0.03）vs（0.50±0.05）]（t=-7.413，P=0.000）起效；作用72 h時，PFD 400μg/ml[（0.62±0.15）vs（0.75±0.12）]（t=-3.507，P=0.002），PFD 800μg/ml [（0.55±0.10）vs（0.72±0.12）]（t=-8.017，P=0.000），PFD 1 600μg/ml[（0.54±0.07）vs（0.72±0.12）]（t=-7.725，P=0.000）起效。根據(jù)以上實驗，篩選PFD作用的有效濃度范圍為400～1 600μg/ml，抑制作用呈劑量依賴性，作用48 h抑制作用最明顯。見圖1。

圖1 不同濃度PFD對CFB增殖的影響（MTT法）

2.2 PFD對TGF-β1誘導(dǎo)CFB增殖的影響（MTT法）

根據(jù)上述實驗結(jié)果，選用PFD400和1600μg/ml為低濃度組和高濃度組，作用時間選擇48h。TGF-β1（5 ng/ml）能刺激CFB增殖[（1.68±0.14）vs（1.36± 0.08）]（t=2.373，P=0.003），PFD 400[（1.09±0.12）vs（1.36±0.08）]（t=-1.203，P=0.003）和1 600μg/ml [（0.97±0.17）vs（1.36±0.08）]（t=-4.507，P=0.000）能抑制CFB增殖，高濃度組優(yōu)于低濃度組[（0.97± 0.17）vs（1.09±0.12）]（t=-1.207，P=0.005）。PFD 400 [（1.1 6±0.17）vs（1.68±0.14）]（t=-5.086，P=0.000）和1600μg/ml[（1.05±0.12）vs（1.68±0.14）]（t=-2.419，P=0.001）能顯著抑制TGF-β1（5 ng/ml）誘導(dǎo)CFB增殖，低濃度400μg/ml即能起明顯抑制作用，1 600μg/ml的抑制效果強(qiáng)于400μg/ml[（1.05±0.12）vs（1.1 6±0.17）]（t=-1.010，P=0.021）。見圖2。

2.3 心肌成纖維細(xì)胞ColⅠ的RT-qPCR檢測

TGF-β1（5ng/ml）的心肌成纖維細(xì)胞ColⅠmRNA表達(dá)增加[（2.07±0.44）vs（1.00±0.38）]（t=8.682，P= 0.000），PFD 400[（0.59±0.24）vs（1.00±0.38）]（t =-4.914，P=0.002）和1 600μg/ml[（0.41±0.21）vs（1.00±0.38）]（t=-6.336，P=0.001）能抑制心肌成纖維細(xì)胞ColⅠmRNA表達(dá)，高濃度組優(yōu)于低濃度組[（0.41±0.21）vs（0.59±0.24）]（t=-1.580，P=0.050）。同時PFD 400[（0.76±0.36）vs（2.07±0.44）]（t=-9.023，P=0.000）和1 600 μg/ml[（0.64±0.27）vs（2.07±0.44）]（t=-9.988，P=0.000）能顯著抑制TGF-β1（5 ng/ml）誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞ColⅠmRNA表達(dá)，高濃度組優(yōu)于低濃度組細(xì)胞ColⅠmRNA表達(dá)[（0.64±0.27）vs（0.76±0.36）]（t=-1.523，P=0.402），低濃度400μg/ml即能起明顯抑制作用。見圖3。

圖2不同濃度PFD對TGF-β1誘導(dǎo)CFB增殖的影響（MTT法）

2.4 心肌成纖維細(xì)胞ColⅠ的Western blot檢測

TGF-β1（5 ng/ml）能刺激心肌成纖維細(xì)胞ColⅠ蛋白的表達(dá)，PFD 400和1 600μg/ml能抑制心肌成纖維細(xì)胞ColⅠ蛋白的表達(dá)，高濃度組優(yōu)于低濃度組。同時PFD 400和1 600μg/ml能顯著抑制TGF-β1（5 ng/ml）誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞ColⅠ蛋白的表達(dá)，低濃度400 g/ml即能起明顯抑制作用。見圖4。

圖4 不同濃度PFD對TGF-β1誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞ColⅠ的檢測（Western blot法）

3 討論

心肌間質(zhì)纖維化是各種心臟疾病發(fā)展為終末期的共同通路，其主要特征是間質(zhì)成纖維細(xì)胞的大量增殖、活化以及成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分大量沉積[1]。UMF是在慢性腎臟病基礎(chǔ)上并發(fā)心肌肥大和心室重塑的主要病理基礎(chǔ)。隨著慢性腎臟病的進(jìn)展，腎間質(zhì)纖維化程度逐漸升高，尿毒癥患者體內(nèi)以TGF-β為代表的促纖維化因子逐漸升高。UMF是在除心肌機(jī)械壓力和容量負(fù)荷外，炎癥因子及致纖維化因子刺激，代謝毒物的毒性作用及營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏（如白蛋白和某些微量元素）或失衡等綜合作用造成的心肌特異性病變。

PFD是新型的吡啶酮類化合物，具有抗肺[2-3]、肝[4-5]、腎[6-7]及皮膚[8-9]纖維化作用，但目前PFD對尿毒癥心肌纖維化的研究少有報道。本研究以TGF-β1刺激CFB，建立大鼠尿毒癥心肌纖維化細(xì)胞模型。本實驗發(fā)現(xiàn)，0～1 600μg/ml PFD對CFB作用24、48和72h，能抑制CFB增殖。PFD在有效濃度范圍內(nèi)作用時間在24 h時，1 600μg/ml PFD起效；48 h時，400～1600μg/ml PFD即能起到明顯的抑制作用，當(dāng)作用時間延長為72 h時，400、800和1 600μg/ml有效，但作用強(qiáng)度不如48 h，作用強(qiáng)度呈濃度依賴性，未呈時間依賴性。

筆者繼續(xù)選用400和1 600μg/ml PFD為低濃度組和高濃度組，以48h為干預(yù)時間點，觀察PFD對TGF-β1誘導(dǎo)CFB增殖和分泌膠原蛋白的影響。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能刺激CFB增殖、促進(jìn)ColⅠmRNA和ColⅠ表達(dá)，在無TGF-β1刺激的情況下，PFD 400和1 600μg/ml能抑制CFB增殖、抑制ColⅠmRNA和ColⅠ表達(dá)；同時PFD 400和1 600μg/ml能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)CFB增殖、ColⅠmRNA和ColⅠ表達(dá)，400μg/ml即能起明顯抑制作用。文獻(xiàn)報道，PFD可成濃度依賴性模式抑制血小板源性生長因子誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞增殖，最大濃度為1 875μg/ml[10]。本實驗中最大濃度為1 600μg/ml，與該濃度相近，PFD藥物濃度再增加時血漿溶解度降低。說明PFD對不同成纖維細(xì)胞的作用濃度相似，作為抗纖維化藥物，PFD抑制成纖維細(xì)胞增殖效果穩(wěn)定可靠。

AZUMA等[11]在日本進(jìn)行特發(fā)性肺纖維化的Ⅱ期臨床實驗中，107例特發(fā)性肺纖維化患者被隨機(jī)分為兩組，分別接受PFD（72例，1 800 mg/d）和安慰劑（35例）治療。觀察時間為9個月，發(fā)現(xiàn)PFD治療組患者6 min運動實驗最低氧飽和度、肺活量下降和急性加重的發(fā)病率較安慰劑組明顯改善，該研究的PFD劑量為1 800 mg/d。SHARMA等[12]在2011年對PFD治療糖尿病腎病的研究中發(fā)現(xiàn)，通過1年的觀察，低劑量組（PFD1200mg/d）較高劑量組（PFD 2 400mg/d）和安慰劑組腎小球濾過率上升3.3～2.2 ml/（min· 1.73 m2），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在77例患者中，低劑量組未進(jìn)入透析，高劑量組1例進(jìn)入透析，安慰劑組4例進(jìn)入透析。該兩項研究表明，PFD的人體實驗最佳參考劑量為1 200～1 800 mg/d，同細(xì)胞實驗基本一致，中等劑量組作用效果優(yōu)于高劑量組。

本研究為PFD和類似的吡啶酮類化合物抗纖維化作用機(jī)制，以及進(jìn)一步的細(xì)胞、動物和臨床實驗的研究提供參考。

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（申海菊 編輯）

Effect of Pirfenidone on TGF-β1induced proliferation and collagen synthesis of rat cardiac fibroblasts*

Lin-na WANG1,Chang-yong CHEN2,Cun-xia GUO1, Xiao-yong CHEN1,Xiang-mei CHEN3
[1.Department of Nephrology,Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou,Henan 450002,P.R.China;2.Department of Radiology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,P.R.China;3.Department of Nephrology(State Key Laboratory of Kidney Disease),the General Hospital of Chinese PLA, Beijing,100853,P.R.China]

【Objective】To investigate the effect of Pirfenidone(PFD)on transforming growth factor-β1 (TGF-β1)induced proliferation and typeⅠcollagen(ColⅠ)synthesis in rat cardiac fibroblasts(CFB)and explore its anti-fibrotic mechanism.【Methods】Cardiac fibroblasts were treated with PFD of different concentrations(0,100,200,400,800 and 1,600 μg/ml)for 24,48 and 72 hours.Cell proliferation activity was detected by MTT assay and then the appropriate concentration and time of Pirfenidone were found out. The cultured cardiac fibroblasts were stimulated with TGF-β1and then treated with PFD of different concentrations(400 and 1,600 μg/ml)for 48 hours.Cell proliferation activity was detected by MTT assay,the expression of typeⅠcollagen mRNA was determined by real-time quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction(RT-qPCR)and the amount of typeⅠcollagen in cultured cells was measured byWestern bolt.【Results】Pirfenidone inhibited cardiac fibroblast proliferation stimulated with TGF-β1,the expression of typeⅠcollagen mRNA and the amount of typeⅠcollagen.The effective concentration of Pirfenidone was 400～1,600 μg/ml for 48 h after Pirfenidone was added into culture medium,the concentration of400 μg/mlworkedsignificantly.【Conclusion】Pirfenidonecaninhibitcardiacfibroblastproliferation stimulated with TGF-β1and collagen production which may contribute to its anti-fibrotic mechanism.

Pirfenidone；cardiac fibroblast；uremia；typeⅠcollagen；transforming growth factor-β1

R542.23；R96

A

1005-8982（2015）29-0030-05

2015-02-09

河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項基金（No：2014ZY02021）

王琳娜，現(xiàn)在中國人民解放軍總醫(yī)院腎臟病科暨腎臟疾病國家重點實驗室從事博士后研究，Tel：18601268901；E-mail：18925378@qq.com