心腎綜合征模型建立及腎素原受體信使核糖核酸表達的研究

王蕾，王梓，郝迪，李旭，袁玲，劉洪斌

心腎綜合征模型建立及腎素原受體信使核糖核酸表達的研究

王蕾，王梓，郝迪，李旭，袁玲，劉洪斌

目的：通過“腹主動脈縮窄（CAA）合并腎臟急性缺血再灌注損傷（RIRI）”建立大鼠心腎綜合征（CRS）模型，并觀察腎素原受體信使核糖核酸的表達。

方法：將42只Wistar大鼠按照體重隨機分成4組（每組10只，造模過程中死亡2只）：假手術(shù)組、CAA組、RIRI組、CAA+ RIRI組。術(shù)后觀察16周。酶聯(lián)免疫法測定血清B型利鈉肽（BNP），苦味酸法測定血肌酐（Cr），酶偶聯(lián)速率法測定血清尿素氮（BUN），放射免疫法測定血漿腎素活性、血管緊張素-Ⅰ（Ang-Ⅰ）和Ang-Ⅱ、醛固酮含量；小動物超聲心動圖監(jiān)測大鼠心臟舒張末期室間隔厚度（IVS）、舒張末期左心室后壁厚度（LVPW）、左心室射血分數(shù)（LVEF）；記錄心室重量指數(shù)、全心重量指數(shù)、腎臟重量指數(shù)，蘇木素-伊紅（HE）染色觀察心肌、腎臟組織病理變化；熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法測定心室肌、腎臟組織腎素原受體信使核糖核酸表達。

結(jié)果：CAA、RIRI、CAA+RIRI三組血清BNP均較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）；CAA+RIRI組血清Cr、BUN較CAA組顯著升高（P＜0.01），血漿醛固酮含量較假手術(shù)組和RIRI組均明顯升高（P均＜0.05）；CAA+RIRI組的腎素活性較CAA組明顯升高（P＜0.05），但三個術(shù)式組血漿Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ無明顯升高（P＞0.05）。CAA+RIRI組IVS和LVEF變化程度較CAA組更明顯（P均＜0.01），CAA+RIRI組心室肥厚較RIRI組明顯（P＜0.05）。CAA+RIRI組心室和全心重量明顯高于RIRI組（P＜0.05），HE染色可見心肌細胞束的間隙稍增寬；左腎指數(shù)減小程度最明顯，腎小管重度萎縮，部分腎小球萎縮。熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心室肌和腎臟組織中均有腎素原受體表達，CAA、RIRI、CAA+RIRI三組大鼠腎素原受體表達均較假手術(shù)組減弱。

結(jié)論：CAA+RIRI復(fù)合術(shù)式對心肌和腎臟同時構(gòu)成損傷，損傷程度較CAA或RIRI單一術(shù)式更嚴重，手術(shù)方法可控性好、一致性高。該方法為腎素原受體用于CRS的治療新途徑研究提供了方法學(xué)參考。

腎素原受體；心腎綜合征；腎臟急性缺血再灌注損傷；腹主動脈縮窄

Methods: A total of 42 Wistar rats were randomly divided into 4 groups: Sham group, CAA group, RIRI group and CAA+RIRI group. n=10 in each group, 2 rats died during the modeling and all animals were treated for 16 weeks. Blood levels of BNP, creatinine (Cr), urea nitrogen (BUN), the activity of rennin, the contents of angiotensin-I (AT-I), AT-II and aldosterone were examined by laboratory test. The diastolic end inter-ventricular septum thickness (DEIVST), DELVPT, LVEF, ventricular weight index (VWI) and cardiac weight index were detected by small animal echocardiography. The histological changes of myocardium and kidney tissue were measured by HE staining, and the mRNA expressions of pro-renin receptor in myocardium and kidney tissues were measured by RT-PCR.

Results: Compared with Sham group, blood levels of BNP were increased in the other 3 groups, P＜0.05; compared with CAA group, CAA+RIRI group had increased levels of Cr and BUN, P＜0.01; compared with Sham group and RIRI group, CAA+RIRI group showed increased blood level of aldosterone, P＜0.05. Compared with CAA group, CAA+RIRI group presented increased rennin activity, P＜0.05. Blood levels of AT-I and AT-II were not significantly increased among 3 operation groups, P＞0.05. Compared with CAA group, CAA+RIRI group had more obvious changes of DEIVST and LVEF, P＜0.01. Compared with RIRI group, CAA+RIRI group had more obvious ventricular hypertrophy, higher VWI and cardiac weight index, all P＜0.05. HE staining presented that CAA+RIRI group had broadening of myocardial cell bundle space, decreased left renal index, severe tubular atrophy and partial glomerular atrophy. RT-PCR demonstrated that compared with Sham group, the mRNA expressions of pro-renin receptor in myocardium and kidney tissues were decreased in the other 3 groups.

Conclusion: Combined CAA+RIRI method may damage the cardial and renal tissues at the same time which was more severe than either CAA or RIRI. While CAA+RIRI model has better controllability and higher consistency that provides a methodological reference for pro-renin receptor in treating CRS in experimental rat’s model.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:895.)

心腎綜合征（CRS）是心臟和腎臟衰竭的終末期階段，在已報道的動物模型中，難以實現(xiàn)“心損及腎、腎損及心”或“心腎共損”的病理程度，一定程度上限制了CRS的研究。本研究旨在通過腹主動脈縮窄（CAA）+腎臟急性缺血再灌注損傷（RIRI）造模方法來增加心臟和腎臟的損傷程度，實現(xiàn)心腎功能共損、互損，模擬臨床CRS病變特點。

腎素原受體廣泛存在于心臟、腦、腎臟、胚胎和肝臟，腎素原與腎素原受體結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化，使血管緊張素原向血管緊張素-Ⅰ（Ang-Ⅰ）轉(zhuǎn)化的效率提高至4倍[1,2]。腎素原受體還具備亞細胞功能[3]，可以激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[2]，在糖尿病腎病和心臟纖維化的研究中具有重要意義[4,5]。本研究觀察CRS大鼠模型心室肌和腎臟中腎素原受體表達情況，以闡明腎素原受體對心腎共損的介導(dǎo)作用，為腎素原受體用于CRS的治療新途徑研究提供方法學(xué)參考。

1 材料和方法

材料和分組：Wistar大鼠42只，雌雄各半，體重290～300 g，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心[許可證號：SCXK（軍）2009-0003和SCXK（京）2006-0009]，隨機分為4組（每組10只）：假手術(shù)組、CAA組、RIRI組、CAA+ RIRI組（造模過程中死亡2只）。

造模方法：假手術(shù)組大鼠僅開腹，腹腔內(nèi)滴入慶大霉素預(yù)防感染，分層關(guān)閉腹腔。CAA組建立慢性心力衰竭大鼠模型。大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉后，暴露分離后腹膜，在左腎動脈上方游離腹主動脈，將腹主動脈縮窄成直徑為0.7 mm的殘腔。RIRI組建立急性腎損傷-慢性腎臟病模型。大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉后，阻斷腎蒂結(jié)扎30 min后，恢復(fù)血流。CAA+RIRI組大鼠先行RIRI手術(shù)，恢復(fù)血流后即刻行CAA手術(shù)，建立CRS模型。

試劑和設(shè)備：2×NI-RT Master Mix（目錄號：306503），×Real Master Mix （SYBR GreenI）（目錄號：308101），I-DNA Marker Ⅰ（目錄號： A01103）。Visual Sonic Vevo?2100小動物超聲成像系統(tǒng)；全自動雙探頭放射免疫γ計數(shù)器（SN-697）；科華360酶標(biāo)儀；Bio-rad IQ5 實時定量PCR儀；日本Fisher Model 266 MP自動石蠟包埋機；西德Leica RM2135切片機；日本OLYMPUS B071型顯微攝影器材；IDA-2000高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)；偏振光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：OLYMPUS BX53）。

大鼠血清B型利鈉肽（BNP）、血清尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）的測定：術(shù)后16周，大鼠經(jīng)腹主動脈采血，2 500 r/min離心15 min，分離血清。酶聯(lián)免疫法測定BNP含量，酶偶聯(lián)速率法測定BUN，苦味酸法測定血Cr。

大鼠腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)測定：大鼠全血分別置特殊抗凝及肝素抗凝，放射免疫法測定腎素活性、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ、醛固酮含量。

大鼠超聲心動圖檢查：大鼠麻醉后，固定于小動物解剖臺上，分別測量心臟舒張末期室間隔厚度（IVS）、舒張末期左心室后壁厚度（LVPW）、左心室射血分數(shù)（LVEF），各個值分別取3個心動周期的平均值。

大鼠全心、心室、腎臟重量指數(shù)：將大鼠心臟及雙側(cè)腎臟取出，分離心室，稱量全心濕重、心室

濕重、左腎濕重、右腎濕重，計算全心重量指數(shù)（全心肌濕重×100%/體質(zhì)量）、心室重量指數(shù)（心室肌濕重×100%/體質(zhì)量）、左側(cè)和右側(cè)腎臟重量指數(shù)（腎臟濕重×100%/體質(zhì)量）。

大鼠心肌、腎臟組織病理蘇木素-伊紅（HE）染色：10%福爾馬林液固定大鼠心臟、腎臟組織標(biāo)本，常規(guī)取材，酒精梯度脫水，Leica EG1150H自動生物組織包埋機包埋，Leica RM2255切片機制片，HE染色，OLYMPUS顯微鏡觀察，IDA-2000高清晰度數(shù)碼顯微圖象分析系統(tǒng)采圖。

大鼠心室肌和腎臟腎素原受體信使核糖核酸（mRNA）表達：（1）RNA提取[1]：mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸（cDNA）、聚合酶鏈式反應(yīng)擴增腎素原受體。用GAPDH作為內(nèi)參。大鼠腎素原受體上游引物：TGACCTGCTATTTCTTTCTG；下游引物：TCTTCTCCATAACGCTTCC，產(chǎn)物長度為150 bp。大鼠GAPDH上游引物：TTCAACGGCACAGTCAAG；下游引物：CCACGACATACTCAGCAC，產(chǎn)物長度為124 bp。腎素原受體 mRNA相對表達量計算方法：目的基因量=2－△△Ct（2－△△Ct表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)）；△△Ct=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。

2 結(jié)果

四組大鼠血清BNP、Cr、BUN比較（表1）：與假手術(shù)組比較，CAA、RIRI、CAA+RIRI三組大鼠血清BNP均明顯升高（P＜0.05），CAA組大鼠血清BUN和Cr明顯升高，RIRI組大鼠術(shù)后16周血清BUN和Cr恢復(fù)至正常水平，CAA+RIRI組大鼠血清BUN和Cr升高，與CAA組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

四組大鼠腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的比較（表2）：腎素活性在三個手術(shù)組表現(xiàn)不一致，CAA組腎素活性不升高，RIRI組與CAA+RIRI組腎素活性升高不明顯，但CAA+RIRI組腎素活性較CAA組明顯升高（P＜0.05）。三個手術(shù)組Ang-Ⅰ和Ang-Ⅱ均未明顯升高。CAA+RIRI組醛固酮水平較假手術(shù)組（P＜0.05）和RIRI組（P＜0.01）均明顯升高。

表1 四組大鼠血清B型利鈉肽、尿素氮和肌酐的比較（

表1 四組大鼠血清B型利鈉肽、尿素氮和肌酐的比較（

注：CAA：腹主動脈縮窄；RIRI：腎臟急性缺血再灌注損傷。與假手術(shù)組比較*P＜0.05**P＜0.01；與CAA組比較△P＜0.05；與RIRI組比較▲P＜0.01

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表2 四組大鼠腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的比較

注：與假手術(shù)組比較*P＜0.05；與CAA組比較△P＜0.05；與RIRI組比較▲P＜0.01。余注見表1

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四組大鼠超聲心動圖檢查結(jié)果比較（表3）：與假手術(shù)組比較，CAA組與CAA+RIRI組大鼠心臟舒張末期IVS和LVPW明顯增高（P均＜0.01），LVEF明顯降低（P＜0.01），而上述指標(biāo)在RIRI組與假手術(shù)對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CAA+RIRI組大鼠心臟舒張末期IVS和LVEF變化程度較CAA組更明顯（P均＜0.01）。

表3 四組大鼠超聲心動圖檢查結(jié)果比較

表3 四組大鼠超聲心動圖檢查結(jié)果比較

注：IVS：室間隔厚度； LVPW：左心室后壁厚度； LVEF：左心室射血分數(shù)。與假手術(shù)組比較*P＜0.01；與CAA組比較△P＜0.01；與RIRI組比較▲P＜0.01。余注見表1

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四組大鼠心臟和腎臟重量指數(shù)比較（表4）：（1）心臟重量指數(shù)變化：CAA組與CAA+RIRI組大鼠全心和心室重量指數(shù)均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），RIRI組大鼠心臟重量指數(shù)較假手術(shù)組無明顯增加（P＞0.05）。CAA+RIRI組大鼠較RIRI組心室明顯肥大（P＜0.05），但與CAA組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）腎臟重量指數(shù)變化：與假手術(shù)組相比，RIRI組大鼠左腎未明顯縮小，CAA組和CAA+RIRI組大鼠左腎重量指數(shù)均明顯減?。≒均＜0.01），CAA+RIRI組變化較CAA組更明顯。CAA、RIRI、CAA+RIRI三組大鼠右腎重量指數(shù)較假手術(shù)組均明顯增加（P均＜0.01），CAA+RIRI組右腎代償最明顯，與CAA組和RIRI組比較均有顯著差異（P均＜0.01）。

表4 四組大鼠心臟和腎臟重量指數(shù)比較

表4 四組大鼠心臟和腎臟重量指數(shù)比較

注：與假手術(shù)組比較*P＜0.01；與CAA組比較△P＜0.01；與RIRI組比較▲P＜0.01。余注見表1

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大鼠心肌和腎臟HE染色（圖1）：CAA組心肌間隙增寬，RIRI組腎組織病理改變不明顯，而CAA+RIRI組大鼠心肌和腎臟均有病理性改變，左腎腎小管重度萎縮，部分腎小球萎縮，可見管型（圖1A），腎實質(zhì)見大片壞死并有脂褐素沉著（圖1B）；心肌細胞束的間隙稍增寬，心肌細胞著色不均（圖1C）。

圖1 CAA+RIRI組大鼠心臟和腎臟蘇木素-伊紅染色（×200）

四組大鼠心室肌和腎臟組織中腎素原受體mRNA的表達情況（圖2）：熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)檢查結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心室肌和腎臟組織中均有腎素原受體 mRNA表達，CAA、RIRI、CAA+RIRI三組大鼠腎素原受體 mRNA表達均較假手術(shù)組減弱（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 四組大鼠腎臟和心肌中腎素原受體信使核糖核酸相對表達量（n=10）

3 討論

目前較為經(jīng)典的慢性心力衰竭動物造模方法有：手術(shù)致心臟前、后負荷加重，冠狀動脈結(jié)扎致缺血性心肌病，心肌毒性化學(xué)物質(zhì)，基因敲除及轉(zhuǎn)基因動物等；腎臟衰竭造模多采用單側(cè)全腎或部分腎組織切除、腎蒂或腎動脈永久結(jié)扎或缺血再灌、化學(xué)物質(zhì)合并腎臟切除術(shù)等方法。以上各方法均可模擬不同程度的心臟、腎臟功能損傷，但在“心腎共損”程度上難以滿足基礎(chǔ)研究需要。已報道的CRS造模方法大多為大鼠急性心肌缺血合并腎組織切除術(shù)[6-9]，且這種方法對心腎損傷的程度，既往報道不一致。此次我們采用CAA法致慢性心力衰竭、RIRI法致慢性腎臟病，其病生理過程更模擬人類疾病的發(fā)展特點。

大鼠腎臟RIRI模型手術(shù)操作簡單，不出血，手術(shù)過程可控性好，一致性強[10]。在RIRI致急性腎臟損傷轉(zhuǎn)歸為慢性腎臟病的報道中，可見腎臟缺血再灌注24 h內(nèi)，腎臟血流量下降50%～75%，同時伴隨血清Cr急劇升高，術(shù)后1～2周恢復(fù)至正常水平[7]，2～4周內(nèi)腎小管結(jié)構(gòu)分化重建[11]。蛋白尿和腎間質(zhì)纖維化改變是由急性腎臟損傷向慢性腎臟病轉(zhuǎn)變的內(nèi)在修復(fù)過程[12]，管周毛細血管稀疏是腎臟纖維化前的恢復(fù)階段，但可加重缺氧，從而向慢性腎臟病發(fā)展。我們的研究證實，急性腎臟損傷可造成腎臟缺血、纖維化、壞死。RIRI合并CAA術(shù)式可明顯加重腎臟損傷程度。

腎素原受體的功能主要有Ang-Ⅱ依賴和非Ang-Ⅱ依賴兩方面，目前對腎素原受體治療機制的研究熱點集中在后者。腎素和腎素原與腎素原受體結(jié)合后，腎素原受體可誘導(dǎo)絲氨酸和絡(luò)氨酸殘基的磷酸化（MAPK），激發(fā)MAPK細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）生成增加[4]。ERK1/2細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用即使在Ang-Ⅱ受體拮抗劑（ARB）氯沙坦存在的情況下亦能被激活[13]，表明這一作用是不依賴于Ang-Ⅱ的產(chǎn)生，而是通過受體直接介導(dǎo)的。Huang等[13]的研究證實，在大鼠巨噬細胞中，腎素可以通過腎素原受體增強ERK磷酸化，從而增加轉(zhuǎn)化生長

因子-β1、纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原和PAI-1的表達，進而引起腎臟纖維化,而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和ARB無法抑制這一信號傳導(dǎo)通路。有研究報道，ERK1/2的表達和活化可能參與了糖尿病腎病小鼠腎纖維化的發(fā)病過程[14]。因此，腎素原受體在CRS大鼠心臟和腎臟的表達是對腎素原受體介導(dǎo)MAPK信號通路對CRS進行調(diào)控的實驗基礎(chǔ)。本研究表明，腎素原受體 mRNA在假手術(shù)組大鼠心室肌和腎臟組織中均有表達，而在CAA、RIRI、CAA+RIRI三組大鼠中的表達均減弱，CAA+RIRI組大鼠心肌和腎臟纖維化明顯。

綜上所述，CAA+RIRI手術(shù)方法操作簡單、可控性好、一致性高，可在不同程度加劇慢性心力衰竭和慢性腎臟病進展。該方法建立的CRS模型可用來研究腎素原受體介導(dǎo)的心肌和腎臟纖維化的調(diào)控作用機制，為腎素原受體用于CRS的治療新途徑研究提供了方法學(xué)參考。

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Establishment of Cardio-renal Syndrome and the mRNA Expression of Pro-renin Receptor in Experimental Rat’s Model

WANG Lei, WANG Zi, HAO Di, LI Xu, YUAN Ling, LIU Hong-bin.
Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences, Tianjin (300020), China

Objective: To establish the cardio-renal syndrome (CRS) model by coarctation of abdominal aorta (CAA) with renal ischemia reperfusion injury (RIRI), and to observe the mRNA expression of pro-renin receptor [(P)RR] in experimental rats.

Pro-renin receptor; Cardio-renal syndrome; Acute renal ischemia reperfusion injury; Coarctation of abdominal aorta

2015-01-30）

（編輯：朱柳媛）

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（81202801）；天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合專項（13180）

300020 天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所

王蕾 副研究員 碩士 主要研究方向為心腦血管藥理學(xué) Email: zws9905@sina.com 通訊作者：劉洪斌 Email: jtss@sina.com

R54

A

1000-3614（2015）09-0895-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.09.017