流式細胞術(shù)檢測體外微核方法的建立

歐紅梅，周長慧，涂宏剛，黃鵬程，常 艷*

（中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203）

流式細胞術(shù)檢測體外微核方法的建立

歐紅梅，周長慧，涂宏剛，黃鵬程，常 艷*

（中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203）

體外微核試驗以微核作為遺傳毒性檢測終點，可用于染色體斷裂劑及非整倍體誘導(dǎo)劑的檢測，在化合物遺傳毒性評價的體外試驗系統(tǒng)中占據(jù)重要地位。2008年，歐洲替代方法驗證中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM）發(fā)布了體外微核試驗可以替代體外染色體畸變試驗用于遺傳毒性檢測的指導(dǎo)原則［1］。2010年，體外微核試驗被經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）指導(dǎo)原則TG487列入體外遺傳毒性試驗的選擇之一［2］。2011年，體外微核試驗被國際協(xié)調(diào)委員會（International Conference on Harmonization， ICH）列入指導(dǎo)原則S2R（1）［3］。體外微核試驗檢測方法簡單，易于自動化［4-7］。流式細胞術(shù)作為微核自動化檢測方法之一，具有高效、準(zhǔn)確、客觀及操作簡單等優(yōu)勢［8］。

本研究的目的是建立流式細胞術(shù)體外微核檢測方法，探討此方法用于藥物早期遺傳毒性篩選和遺傳毒性評價的可能性。本試驗以絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）和環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）為陽性藥，分別以流式細胞儀檢測和人工閱片為微核檢測方法，并對兩種檢測方法得到的微核率進行相關(guān)性分析。流式細胞術(shù)體外微核檢測采用96孔板EMA和SYTOX Green雙色標(biāo)記技術(shù)，并加入計數(shù)珠以評價化合物誘導(dǎo)的細胞毒性；人工閱片采用細胞分裂阻滯法，在細胞培養(yǎng)皿中處理，處理完成后進行低滲、固定、滴片，讀片前用吖啶橙染色。此外本文采用流式細胞術(shù)分析EMA染色情況獲得細胞毒性信息，分析SYTOX G reen染色情況評價MMC和CP對細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cells，CHO-K1）購自ATCC；DMEM/F-12培養(yǎng)基購自Corning公司；胎牛血清和Trypsin-EDTA（1×）購自Gibco公司；MMC購自Roche公司；CP和細胞松弛素B（cytochalasin B，CytoB）購自Sigma公司；S9購自Moltox公司；In V itro M icroFlow?K it 由 Litron L abs提供；6 Micron Fluorescent Latex Microspheres購自Invitrogen公司；流式細胞儀為BD公司的ACCURITMC 6。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 復(fù)蘇CHO-K1細胞，培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)條件下維持培養(yǎng)。每周傳代2～3次，準(zhǔn)備足夠量的對數(shù)生長期細胞供試驗使用。

1.2.2 受試物溶液和代謝活化系統(tǒng) MMC和CP以無菌去離子水為溶劑。MMC和CP的最高濃度分別為0.2和15 μg/mL。代謝活化系統(tǒng)是S9和輔助因子的混合物，S9的終濃度為1%（V/V），臨用前新鮮配制。

1.2.3 加樣處理 加樣前1天用0.25%的胰酶消化處于對數(shù)生長期的細胞，計數(shù)并調(diào)整細胞密度至所需。96孔板接種密度分別為每孔4.0×103個（-S9處理組）和6.0×103個（+S9處理組）細胞，平皿（100 mm）接種密度為每皿8.0×105～1.0×106個細胞，接種后在37 ℃、CO體

2 積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)過夜。

試驗分為-S9持續(xù)處理組（處理時間為24 h），選擇0.06、0.13 和0.25 μg/mL 3個濃度的MMC處理；+S9短時處理組（處理時間為4 h），選擇3.75、7.50和15.00μg/mL 3個濃度的CP處理。每個濃度設(shè)置 2個復(fù)孔，加樣后24 h后收獲細胞并進行微核檢測。

1.3 流式細胞儀檢測

流式細胞術(shù)體外微核檢測方法不加CytoB阻滯，采用EMA和SYTOX Green雙色標(biāo)記技術(shù)。EMA和SYTOX Green染液包括在試劑盒中，EMA熒光信號收集在FL3通道，SYTOX Green熒光信號由FL1通道收集。EMA可穿過凋亡或壞死細胞的細胞膜，在光活化條件下與DNA以共價鍵結(jié)合，但無法穿過正常細胞膜與DNA結(jié)合；EMA染色結(jié)束時采用緩沖液洗細胞，并用含RNA酶及細胞膜裂解液的SYTOX Green染液染色所有細胞的細胞核。通過EMA和SYTOX Green雙染料染色以區(qū)分正常細胞和凋亡、壞死細胞，達到排除凋亡或壞死細胞對試驗結(jié)果的影響的目的，并加入計數(shù)珠用于評價化合物的細胞毒性。

細胞收獲前可在顯微鏡下觀察，選擇合適的濃度收獲細胞，制備樣品并進行流式細胞術(shù)微核檢測。樣品檢測前，用陰性對照孔調(diào)試模板，保證需要的細胞都在邏輯門內(nèi)。每個濃度檢測分析不少于20 000個細胞。按下式計算相對存活率和微核率。

1.4 顯微鏡閱片

人工閱片采用細胞分裂阻滯的體外雙核微核試驗，CytoB分別在加樣（-S9處理組）和換液（+S9處理組）時加入，終濃度為4 μg/mL。收獲細胞并進行低滲、3次固定、滴片，0.1%的吖啶橙染色。吖啶橙熒光染色的玻片不宜長期保存，故讀片前染色。選擇背景清晰、分散良好、染色適宜的細胞觀察。每個濃度計數(shù)不少于1 000個細胞（包括單核、雙核和多核細胞），并計算胞質(zhì)分裂阻滯指數(shù)（cytokinesis-block proliferation index，CBPI）以評價細胞毒性。每個濃度計數(shù)不少于2000個完整的雙核細胞以評價雙核細胞的微核率。

其中，T：處理組；C：溶劑對照組。

1.5 結(jié)果分析與評價

CHO-K1細胞相對存活率應(yīng)不低于50%±5%，如果無明顯細胞毒性的限制，最高濃度為2 000 μg/mL。每一個受試物的每一個處理條件下至少需要3個可分析的濃度。至少一個濃度的微核率和溶劑對照相比有顯著性差異，且有濃度-效應(yīng)關(guān)系，則判定為陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 9.1.3軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，微核率比較使用Fisher精確概率法、四格表卡方檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。人工閱片和流式體外微核檢測方法的比較采用非參數(shù)Spearman系數(shù)分析［9-11］。

2 結(jié) 果

2.1 MMC體外微核試驗結(jié)果

0.06、0.13 和0.25 μg/mL 3個濃度的MMC持續(xù)處理CHO-K1細胞24 h后，相對存活率均大于50%，人工閱片和流式細胞術(shù)兩種方法檢測的微核率與溶劑對照組相比，均呈現(xiàn)顯著性差異（P均＜0.05），且有明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。兩種檢測方法中，MMC誘導(dǎo)CHO-K1細胞產(chǎn)生的微核率均是溶劑對照組的2倍以上，且微核率倍數(shù)均隨著濃度的升高而增大（見表 1）。相同濃度MMC條件下，兩種檢測方法得到的微核率采用SAS非參數(shù)Spearman系數(shù)分析得到rs=1.000，提示兩種檢測方法相關(guān)性好。

2.2 CP體外微核試驗結(jié)果

3.75、7.50 和15.00 μg/mL 3個濃度的CP處理CHOK1細胞4 h后，相對存活率均大于50%，得到人工閱片和流式細胞儀兩種方法檢測的微核率與溶劑對照組相比，均呈現(xiàn)顯著性差異（P均＜0.05），且有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系（見表1）。兩種檢測方法得到中，CP誘導(dǎo)CHO-K1細胞產(chǎn)生的微核率均是溶劑對照組的2倍以上，且微核率倍數(shù)均隨著濃度的升高而增大（見表 1）。相同濃度CP條件下，兩種檢測方法得到的微核率采用SAS非參數(shù)Spearman系數(shù)分析得到rs= 1.000，提示兩種檢測方法相關(guān)性好。

2.3 細胞毒性檢測結(jié)果

MMC和CP作用于CHO-K1細胞后，EMA陽性區(qū)域熒光信號增強，且隨著MMC和CP濃度增加熒光信號增強（見圖1、2）。提示EMA陽性可作為細胞毒性初步判斷的依據(jù)。

2.4 細胞周期檢測結(jié)果

流式細胞儀自動化檢測方法可以通過SYTOX Green在FL1通道的熒光信號面積定性分析化合物對細胞周期的影響。圖中為正常細胞周期信息，靠近坐標(biāo)原點的熒光信號峰為G1期，強度更大的熒光信號峰為G2/M期。本試驗中，MMC和CP對細胞周期的阻滯主要表現(xiàn)在G2/M期，且隨著濃度增加，G2/M期熒光信號呈增強趨勢（見圖 3、4）。

3 討 論

本試驗中，MMC和CP兩個經(jīng)典的遺傳毒性化合物采用流式細胞儀檢測得到的結(jié)果均為陽性，與文獻報道一致［9-10，12］。在有/無代謝活化系統(tǒng)的條件下，流式細胞儀自動化檢測方法和人工閱片的方法的Spearman 系數(shù)rs=1.000，相關(guān)性好。因而，本實驗室初步建立了96孔板流式細胞術(shù)體外微核檢測方法。此方法的優(yōu)點主要包括：①流式細胞儀檢測可以明顯縮短分析時間，每個孔進樣檢測的時間約3 min，比人工閱片的方法快40～100倍；②96孔板流式細胞術(shù)檢測方法樣品處理簡便，貼壁細胞樣品處理可直接在孔板中完成而無需消化、離心，傳統(tǒng)人工閱片方法消化、低滲、3次固定及離心操作則耗時費力；③減少了細胞和待測化合物的使用量，96孔板需要的細胞數(shù)及化合物用量僅為平皿用量的1/100；④可進行高通量的檢測，特別適用于化合物早期遺傳毒性的篩選；⑤EMA和SYTOX Green雙色標(biāo)記可排除凋亡、壞死細胞碎片對微核的干擾，依據(jù)EMA陽性率可初步判斷細胞毒性大小；⑥可以提供細胞周期信息，定性分析待測化合物對細胞周期的影響；⑦計數(shù)珠用于評價細胞毒性有助于減少因過度細胞毒性引起的假陽性結(jié)果。

下一步我們將選擇不同遺傳毒性強度和不同作用機制的遺傳毒性化合物以及非遺傳毒性的化合物進行驗證，分析此方法的靈敏度和特異性。此外體外遺傳毒性試驗假陽性率高倍受研究者們關(guān)注，過度細胞毒性、p53基因型、代謝活化系統(tǒng)和細胞系遺傳穩(wěn)定性等是重要影響因素［13-17］。選擇p53野生型細胞、接近人代謝活化系統(tǒng)的細胞及基因型穩(wěn)定的細胞研究也是我們的努力方向。

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Establishment of flow cytometric in iin viittrro micronucleus assay

OU Hongmei，ZHOU Changhui，TU Honggang，HUANG Pengcheng，CHANG Yan*
（China State Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation & Research， Shanghai 201203， China）

目的： 建立96孔板流式細胞術(shù)體外微核自動化檢測的方法，并探討其用于藥物早期遺傳毒性篩選和遺傳毒性評價的可能性。方法：試驗分為+S9短時處理組（4 h）和-S9持續(xù)處理組（24 h），分別選擇3個不同濃度的環(huán)磷酰胺和絲裂霉素C處理CHO-K1細胞，24 h后收獲細胞。采用EMA和SYTOX Green雙色標(biāo)記，流式細胞儀分析96孔板的微核率，并與常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)平皿培養(yǎng)、細胞分裂阻滯法的雙核微核結(jié)果進行比較。結(jié)果：在有或無S9處理條件下，不同濃度的環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C誘導(dǎo)產(chǎn)生的微核率較溶劑對照組均顯著增加（P均＜0.05），劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。兩種微核檢測方法的Spearman相關(guān)系數(shù)（rs）為1.000。結(jié)論：流式細胞術(shù)檢測環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C作用于CHO-K1細胞的微核試驗結(jié)果均為陽性，與文獻報道一致，因而本試驗初步建立了流式細胞術(shù)體外微核檢測方法。流式細胞術(shù)檢測微核的方法與人工閱片的方法相關(guān)性好，提示該方法用于化合物早期遺傳毒性篩選和遺傳毒性評價具有良好的前景。

CHO-K1細胞；體外微核試驗；流式細胞術(shù)；96孔板

OBJECTIVE:Establish the flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells，and explore the possibility of this method for early genetic toxicity screening during drug discovery. MEHTODS：The test included treatment with and without metabolic activation. For the treatment with metabolic activation，CHO-K1 cells were treated with three different concentrations of cyclophosphamide in the S9 mix medium for 4 h，then incubated with S9-free fresh medium for 20 h. For the treatment without metabolic activation，cells were incubated with three different concentrations of mitomycin C continuously for 24 h. In all cases，after a total of 24 h since initiation of the treatment，cells were processed for microscopic scoring or flow cytometric MN analysis. A flow cytometric method for scoring MN used EMA and SYTOX Green to label the cells in 96-well microplate，and then compared with cytokinesis-block micronucleus assay in cell culture disks based on microscopy.RESULTS：Mitomycin C and cyclophosphamide at different concerntrations caused statistically significant and dose-dependent increasess in micronucleus assay. Non-parametric Spearman's coefficients （rs） is 1.000.CONCLUSION：Similar to literature published， mitomycin C and cyclophosphamide induced positive results in flow cytometric based in vitro micronucleus assay. So the method of flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells was established. The concordance between microscopic scoring and flow cytometric was good，therefore this method is promising for screening and evaluating genetic toxicity of chemicals.

CHO-K1 cells；in vitro micronucleus assay；flow cytometric；96-well microplate

R394.6

A

1004-616X（2015）01-0039-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.009

2014-08-13；

2014-12-21

國家十二五重大新藥創(chuàng)制專項基金資助項目（2012ZX09505001-003）

作者信息：歐紅梅，E-mail：hongmei_ou@126.com。*通信作者，常 艷，E-mail：y chang@ncdser.com